導語：羥基磷灰石涂層材料制備論文一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

〔摘要〕目的：觀察含鑭羥基磷灰石作為涂層材料的細胞相容性。方法：將原代培養(yǎng)的成骨細胞接種到涂層表面，采用細胞計數(shù)觀察第1、7、14、21天細胞在材料表面的附著、增殖情況，采用SEM觀察細胞在材料表面的形態(tài)變化，并且對21d內(nèi)細胞的堿性磷酸酶活性進行檢測。結(jié)果：成骨細胞在材料表面的細胞增殖數(shù)與對照組間無顯著性差異，細胞在材料表面伸展良好，粘附牢固，并具有良好的細胞形態(tài)及增殖率，堿性磷酸酶活性逐漸增加。結(jié)論：含鑭羥基磷灰石涂層材料具有良好的細胞相容性。

關(guān)鍵詞鑭；羥基磷灰石類；涂層；成骨細胞；堿性磷酸酶

鈦合金表面的生物陶瓷涂層以其優(yōu)良的生物學性能已作為種植體材料廣泛應(yīng)用于臨床，目前常用的涂層材料為羥基磷灰石（HA），但已有文獻報道由于涂層工藝及HA穩(wěn)定性的問題，使HA涂層在體內(nèi)迅速溶解而導致種植體的失敗〔1,2〕。本研究在HA中添加了稀土元素鑭，使其晶體更加穩(wěn)定〔3〕，同時采用新的涂層工藝，使其在鈦合金表面形成穩(wěn)定和牢固的涂層。在對該涂層材料的細胞毒性進行研究的基礎(chǔ)上〔4〕，為進一步觀察用含鑭羥基磷灰石涂層后材料的細胞相容性，本實驗在體外研究了該涂層材料與成骨細胞間的相互作用，為進一步的體內(nèi)研究提供了理論和實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1含鑭羥基磷灰石涂層材料的制備

在直徑為10mm，厚1.5mm的鈦表面制備含鑭羥基磷灰石涂層材料La-HA（西安交通大學金屬材料強度實驗室提供），將涂層圓片用體積分數(shù)(φ)為75%乙醇超聲振蕩清洗后，再用三蒸水超聲振蕩清洗3遍，烘干，60Co輻射滅菌后備用。

1.2成骨細胞的培養(yǎng)

本實驗應(yīng)用的成骨細胞來自大鼠顱蓋骨，其培養(yǎng)方法見文獻〔4〕。

1.3細胞在材料表面附著、增殖

將La-HA涂層圓片放入24孔板內(nèi)，加入1ml的DMEM培養(yǎng)液浸泡24h后，將細胞接種于材料表面，濃度為5×107/L。無涂層圓片的培養(yǎng)板作為對照組（Con）；37℃，φ(CO2)=5%的條件下用礦化液（含10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、50mg/L維生素C的DMEM培養(yǎng)液）培養(yǎng)21d，細胞分別在接種后第1、7、14和21天用0.25g/L胰酶0.3ml消化15min,再加0.7ml的DMEM終止消化，充分吹打后，收集消化液。定量后在倒置顯微鏡下進行細胞計數(shù)，每組重復3次，取平均值。

1.4細胞在材料表面的堿性磷酸酶活性

將上述實驗中各時間段的細胞懸液離心、棄上清，加入體積分數(shù)為0.3%Triton-X100100μl，4℃過夜，將其移入96孔板內(nèi)，再加入100μl堿性磷酸酶底物液，37℃孵育40min，加入50μl的1mol/LNaOH終止反應(yīng)，在酶聯(lián)免疫儀上用410nm波長測吸光度（A），統(tǒng)計分析。

1.5細胞在材料表面的形態(tài)學觀察

將培養(yǎng)至第1、7、14、21天的涂層圓片分別取出，用0.01mol/L的PBS（pH7.4）洗3遍，體積分數(shù)為0.3%戊二醛固定，乙腈梯度脫水，臨界點干燥，噴金，掃描電鏡觀察。

2結(jié)果

2.1細胞在材料表面的附著與增殖

圖1顯示出第1、7、14、21天成骨細胞在材料表面附著及增殖的數(shù)量統(tǒng)計。可以看出成骨細胞在材料表面附著及增殖情況良好。第21天細胞增殖的數(shù)量幾乎是第1天細胞附著數(shù)量的6倍。各時間段材料表面的細胞數(shù)量與對照組之間無顯著差異（P≥0.05）。

2.2細胞在材料表面的堿性磷酸酶活性

通過測量成骨細胞分泌的堿性磷酸酶活性的相對強弱來表示成骨細胞在材料表面的功能。從第7、14、21天測試的堿性磷酸酶的吸光度（A）（圖2）可以看出隨著培養(yǎng)時間的增加堿性磷酸酶的活性逐漸增強，各時間點與對照組之間無顯著差異（P≥0.05）。

圖1成骨細胞在材料表面附著及增殖數(shù)

圖2成骨細胞在材料表面的堿性磷酸酶活性

2.3成骨細胞在材料表面形態(tài)學觀察

圖3顯示掃描電鏡下第1、7、14、21天成骨細胞在材料表面的形態(tài)。細胞接種在材料表面的第1天（圖3a）伸展良好，多個細胞突起牢固附著在材料表面。培養(yǎng)至第7天（圖3b）細胞突起伸展到材料表面的顆粒間，胞漿伸展并包裹材料表面的顆粒，在細胞表面也有磷酸鈣顆粒形成。第14天（圖3c）細胞分泌基質(zhì)并連接成網(wǎng)狀，牢固附著在材料表面及顆粒間。第21天（圖3d）細胞分泌的細胞外基質(zhì)更加豐富，貫穿于材料的顆粒間，材料表面也有再結(jié)晶形成。

圖3掃描電鏡下成骨細胞在材料表面的形態(tài)學觀察

3討論

含鑭的羥基磷灰石是本實驗室新研究合成的鈣磷陶瓷材料。在對其理化性能及細胞毒性進行研究的基礎(chǔ)上，將其作為涂層材料進行應(yīng)用基礎(chǔ)研究，對發(fā)展和完善種植材料具有重要意義。本實驗研究將成骨細胞接種在材料表面，使植入材料與骨組織的主要功能細胞--成骨細胞相接觸，不僅可以考察材料對細胞的影響，而且有助于考察材料與細胞間的相互作用，從更深層次探討材料-細胞界面結(jié)合機制，使其結(jié)果與體內(nèi)實驗更加吻合。

細胞在材料表面的附著是成骨細胞在材料表面發(fā)揮功能的前提。體外觀察成骨細胞與材料間的反應(yīng)是有益的，因為體外實驗研究可以較容易觀察材料對細胞附著生長的影響，而不易受到其他系統(tǒng)因素的影響〔5，6〕。本實驗研究即采用體外實驗研究的方法，觀察到成骨細胞可以在含鑭羥基磷灰石涂層材料表面附著并增殖良好。掃描電鏡觀察可以看到成骨細胞在該涂層材料表面伸展良好并牢固附著在材料表面，細胞突起伸展到材料表面的顆粒間，并且隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞分泌大量細胞外基質(zhì)并連接成網(wǎng)。同時在材料表面及細胞表面有新的鈣磷結(jié)晶形成。這說明成骨細胞與該涂層材料間具有良好的相容性。同時本實驗還對成骨細胞在材料表面的功能進行了研究。堿性磷酸酶是成骨細胞分化的主要特征酶之一，以往常用檢測堿性磷酸酶活性來鑒別成骨細胞〔7〕，觀察成骨細胞的功能。本實驗結(jié)果表明隨著細胞的增殖，堿性磷酸酶的活性逐漸增強，說明成骨細胞在該涂層材料表面能發(fā)揮良好的功能。通過以上實驗研究可以初步認為含鑭羥基磷灰石作為涂層材料具有良好的細胞相容性。進一步的工作需結(jié)合體內(nèi)種植實驗觀察來綜合評價該涂層材料的應(yīng)用前景。■

國家自然科學基金資助項目：59872026

作者單位：張玉梅（西安交通大學金屬材料強度國家重點實驗室710049）

傅濤（西安交通大學金屬材料強度國家重點實驗室710049）

徐可為（西安交通大學金屬材料強度國家重點實驗室710049）

王勤濤（第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)學院）

參考文獻

［1］NancollasGH,TuckerBE.Dissolutionkineticscharacterizationofhydroxyapatitecoatingsondetalimplants.JOralImplant，1994，20:221

［2］LewandowskiJA,JohnsonCM.Structuralfailureofosseointegratedimplantsatthetimeofrestoration.Aclinicalreport.JProsthetDent,1989，62:127

［3］張玉梅，傅濤，徐可為.含鑭羥基磷灰石的合成及性能研究.牙體牙髓牙周病學雜志，2000,10(3):149

［4］張玉梅，傅濤，徐可為.含鑭羥基磷灰石的細胞毒性研究.牙體牙髓牙周病學雜志,2000,10(3):152

［5］MatsudaT,DaviesJE.Theinvitroresponseofosteoblaststobioactiveglass.Biomaterials，1987，8:275

［6］VillanuevaJE.NimniME.Modulationofosteogenesisbyisolatedcalvariacells:Amodelfortissueinteractions.Biomaterials，1990，11:13

［7］AttawiaMA.UhrichKE,BotchweyE.etalCytotoxicitytestingofpoly(anhydride-co-imides)fororthopedicapplications，JBiomedMaterRes,1995,29:1233