導(dǎo)語：如何才能寫好一篇胃蛋白酶，這就需要搜集整理更多的資料和文獻(xiàn)，歡迎閱讀由公務(wù)員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

據(jù)報(bào)道，測定血清胃蛋白酶原進(jìn)行胃癌早期診斷的普查以及胃癌的預(yù)防干預(yù)計(jì)劃，已在日本、芬蘭、挪威等國家實(shí)行。日本利用胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ在大面積的人群中進(jìn)行普查，使胃癌的早診率提高到了90％。

以往的研究表明，血清胃蛋白酶原水平可反映不同部位胃黏膜的形態(tài)和功能，聯(lián)合測定胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅰ/Ⅱ比值(PGR)被視為胃黏膜的“血清學(xué)活檢”。

在正常人血清中的胃蛋白酶原Ⅰ濃度是胃蛋白酶原Ⅱ的6倍。胃蛋白酶原Ⅰ正常參考值范圍為67～200 微克/升。

胃蛋白酶原Ⅰ

胃蛋白酶原Ⅰ>200微克/升：提示可能與飲食、藥物的刺激或幽門螺旋桿菌感染以及胃潰瘍、十二指腸潰瘍有關(guān)。

胃蛋白酶原Ⅱ正常參考值范圍

胃蛋白酶原Ⅱ>15微克/升：提示可能與幽門螺旋桿菌感染、胃潰瘍、十二指腸潰瘍以及胃竇部的疾病有關(guān)；

胃蛋白酶原Ⅰ/胃蛋白酶原Ⅱ比值（PGR）正常參考值范圍為>7.5。

PGR

眾多流行病學(xué)證據(jù)表明，胃癌患者胃蛋白酶原Ⅰ較健康者明顯下降，胃蛋白酶原Ⅱ因?yàn)榉植驾^廣、變化不大。而胃癌患者PGR明顯降低，是胃癌的高危信號(hào)。可見，血清胃蛋白酶原的測定是普查中篩選胃癌的良好指標(biāo)。

臨床上，若血清胃蛋白酶原呈現(xiàn)“陽性”結(jié)果，需再進(jìn)一步進(jìn)行多種腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測。這樣?？稍谂R床癥狀出現(xiàn)之前數(shù)月鑒別出復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。胃蛋白酶原陽性者應(yīng)每年檢查一次胃鏡，并進(jìn)行密切隨訪，以早期發(fā)現(xiàn)變化，早期在內(nèi)鏡下進(jìn)行治療，以達(dá)到根治的目的。

篇2

【關(guān)鍵詞】 胃蛋白酶原； 萎縮性胃炎； 胃癌 ；應(yīng)用價(jià)值

Application value of serum pepsinogen detection in early diagnosis of gastric cancer SHI Ling-ling， ZHANG Ying-bo， DONG Lin. Department of Clinical Laboratory， Sanmenxia Central Hospital， Sanmenxia 472000， China

【Abstract】 Objective To investigate the application value of serum pepsinogen detection in early diagnosis of gastric cancer. Methods A total of 89 cases stomach illness were treated as the experimental group， and 40 cases of healthy people as the health control group. Results The levels of pepsinogenⅠ（PGⅠ） and ratio between PGⅠand PGⅡ（PGR） in the atrophic gastritis and gastric cancer groups were all lower than the healthy control group， and the differences were statistically significant （P

【Key words】 Pepsinogen； Atrophic gastritis； Gastric cancer； Application value

全球每年約有1萬例胃癌新發(fā)病例， 居癌癥最常見死因的第二位[1]。在我國胃癌是常見的惡性腫瘤之一， 發(fā)病率和病死率一直居我國惡性腫瘤之首， 早期發(fā)現(xiàn)和早期綜合治療是降低病死率的關(guān)鍵措施[2]。為探討血清胃蛋白酶原（PG）檢測在我國胃癌和癌前病變篩查中的應(yīng)用價(jià)值， 本文采用免疫比濁分析法進(jìn)行血清PG水平檢測， 通過血清PG檢測分析胃病患者血清胃蛋白酶原Ⅰ、Ⅱ水平和胃黏膜病變的關(guān)系以及臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 2012年5月～2013年12月本院門診及住院患者89例， 其中胃癌組17例， 男10例， 女7例， 平均年齡（48.6±11.8）歲；胃潰瘍組29例， 男19例， 女10例， 平均年齡（46.3±10.6）歲；萎縮性胃炎組23例， 男16例， 女7例， 平均年齡（47.8±11.2）歲；淺表性胃炎組20例， 男12例， 女8例， 平均年齡（45.9±10.4）歲；所有患者均經(jīng)胃鏡及病理學(xué)診斷確診。健康對照組40例， 男26例， 女14例， 平均年齡（51.7±14.2）歲， 為本院體檢科健康體檢者， 均無肝、腎、胃等疾病及病史。各組患者一般資料比較， 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）， 具有可比性。

1. 2 檢測方法 受檢者清晨空腹抽血并分離血清， 提取0.5 ml血清于-20℃冰凍保存?zhèn)溆?。血清PGⅠ、PGⅡ含量用日立7600-020全自動(dòng)生化分析儀膠乳增強(qiáng)免疫比濁法檢測， 試劑盒、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品均由北京萬泰公司提供。

1. 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）比較， 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；組間比較采用方差分析。P

2 結(jié)果

2. 1 淺表性胃炎組和胃潰瘍組血清PGⅠ水平和PGR顯著增高， 與健康對照組比， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

2. 2 胃癌陽性檢出率 聯(lián)合檢測PGⅠ和PGⅡ， 胃癌陽性檢出率為88.23%， 萎縮性胃炎陽性檢出率為73.91%， 胃潰瘍陽性檢出率為13.79%， 淺表性胃炎陽性率為5.00%， 而健康對照組檢出率僅為2.50%。在這五組中胃癌陽性檢出率最高， 萎縮性胃炎次之， 淺表性胃炎陽性檢出率最低。見表2。

3 討論

PG是胃蛋白酶的前體， 分為PGⅠ和PGⅡ。PGⅠ和PGⅡ由胃體黏膜的主細(xì)胞和頸黏液細(xì)胞分泌， 但PGⅡ也可由胃竇的幽門腺和十二指腸的Brunner腺分泌[3]。胃黏膜發(fā)生病變時(shí)， PG分泌細(xì)胞受累， 血清PG水平也發(fā)生相應(yīng)變化。因此， 血清PG水映了不同部位胃黏膜的形態(tài)和功能[4]， PGI是檢測胃泌酸腺細(xì)胞功能的指針， 胃酸分泌增多PGI升高， 分泌減少或胃粘膜腺體萎縮PGI降低；PGII與胃底黏膜病變的相關(guān)性較大（相對于胃竇黏膜）， 其升高與胃底腺管萎縮、胃上皮化生或假幽門腺化生、異型增值有關(guān)；PGⅠ/PGⅡ比值進(jìn)行性降低與胃黏膜萎縮進(jìn)展相關(guān)。因此， 聯(lián)合測定PGⅠ和PGⅡ比值可起到胃底腺黏膜“血清學(xué)活檢”的作用[5]。胃癌預(yù)防亞太地區(qū)共識(shí)與指南中第15條：低血清PGⅠ水平和低PGⅠ/PGⅡ比例反映了胃萎縮， 低血清PG可作為萎縮性胃炎的一個(gè)替代標(biāo)志物。第16條：低血清PGⅠ水平和低PGⅠ/PGⅡ比例可作為鑒別胃癌高危人群的標(biāo)志物[6]。而在前面的檢測中萎縮性胃炎陽性檢出率僅次于胃癌的陽性檢出率， 據(jù)報(bào)道有80%以上的胃癌伴有萎縮性胃炎， 而大約10%的萎縮性胃炎可發(fā)展為胃癌[7]， 檢測PG含量可反映胃黏膜狀態(tài)及功能情況。上世紀(jì)90年代日本在臨床試驗(yàn)的基礎(chǔ)上， 血清PG作為慢性萎縮性胃炎的標(biāo)志物已被納入胃癌的篩查項(xiàng)目中， 結(jié)果顯示PG檢測有利于檢出早期胃癌。

近幾年來， 國內(nèi)外大量資料報(bào)道[8， 9]因受檢人群、地區(qū)差異及檢測方法等的不同， 血清胃蛋白酶原檢測篩查胃癌早期臨界值存在很大區(qū)別。目前大多報(bào)道均以日本Miki 等[5]提出的PGⅠ≤70 μg/L和PGⅠ/PGⅡ≤3.0作為臨界值， 靈敏度和特異度分別為77%和73%；而萎縮性胃炎患者PGⅠ/PGⅡ比值的臨界值在HP陰性受試者中為6.0， 而在HP陽性受試者中為3.0。本文采用膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法檢測PGⅠ、PGⅡ含量及PGR， 萎縮性胃炎組PGⅠ及PGR值分別是（56.29±20.14）μg/L和（4.52±1.57）明顯低于健康對照組（81.92±26.22）μg/L和（7.82±1.59）， 而檢測發(fā)現(xiàn)胃癌患者和萎縮性胃炎患者中PGⅠ

綜上所述， 血清PGⅠ、PGⅡ及PGR檢測方便、快捷， 適合大范圍人群。篩查出陽性患者， 通過PG水平的檢測可反映胃黏膜變化， PGⅠ

參考文獻(xiàn)

[1] 汪暢， 王鳳超.血清胃蛋白酶原檢測及其在胃癌篩查中的應(yīng)用進(jìn)展.中華全科醫(yī)學(xué)， 2013， 11（8）：1280-1281.

[2] 費(fèi)鳳英， 王金金， 祝新華， 等. 血清胃蛋白酶原檢測在胃部疾病診斷中的意義.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)， 2012， 27（1）：57-59.

[3] 余苗苗.血清胃蛋白酶原檢測在胃疾病篩查中的應(yīng)用.中國實(shí)用醫(yī)藥， 2012， 7（23）：93-94.

[4] 巫開文， 李國春， 徐巧蓮， 等.胃蛋白酶原檢測對胃部疾病篩查的價(jià)值.國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志， 2012， 33（12）1515-1517.

[5] Miki K， Morita M， Sasajima M， et al. Usefulness of gastric cancer screening using the serum pepsinogen test method. Am J Gastroenterol ， 2003， 98（4）：735-739.

[6] Fock KM， Talley N， Mouyyedi P， et al. 胃癌預(yù)防亞太地區(qū)共識(shí)指南. 錢本余， 譯. 胃腸病學(xué)， 2008， 13（4）：235-236.

[7] 張衛(wèi)東， 孫曉， 牛愛軍.血清胃蛋白酶原檢測在胃部疾病應(yīng)用價(jià)值.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與臨床， 2013， 24（4）：12-13.

[8] 楊瑞生， 石貞玉， 韓大正.血清胃蛋白酶原含量的變化與胃癌相關(guān)分析.中國誤診學(xué)雜志， 2001， 11（31）：764-765.

[9] Pomytkina TE. The serum content of gastrin-17 and pepsinogen-1 in patients with duodenal ulcerative disease in occupational contact with nitrogenous com-pounds. Klin Lab Diagn， 2009（11）：16-19.

[10] 邱志奇， 溫少磊， 譚智毅. 胃蛋白酶原Ⅰ、Ⅱ及其比值在胃癌篩查中的應(yīng)用.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床， 2013， 10（14）：1806-1807.

篇3

關(guān)鍵詞 嬰兒生理性腹瀉 復(fù)方胃蛋白酶散 寶樂安

doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2012.01.163

生理性腹瀉多見于6個(gè)月以下的嬰兒，其外觀虛胖，常有濕疹，出生后不久即腹瀉，每天大便次數(shù)多，甚至十幾次，每次大便量不一定很多，其中含少量水分，一般沒有特殊腥臭味。生理性腹瀉的嬰兒除大便次數(shù)增多外，多無其他癥狀，食欲好，無嘔吐，生長發(fā)育不受影響，添加輔食后，大便即逐漸轉(zhuǎn)為正常。但是長時(shí)間的生理性腹瀉容易繼發(fā)細(xì)菌性腸炎，肛周糜爛，嚴(yán)重者可發(fā)生脫水、生長發(fā)育遲緩［1］，偶爾也可發(fā)生短暫的腸絞痛，致使患兒長時(shí)間哭鬧，因此嬰兒生理性腹瀉也需要積極的治療。應(yīng)用復(fù)方胃蛋白酶散聯(lián)合寶樂安治療嬰兒生理性腹瀉，取得滿意的療效，現(xiàn)報(bào)告如下。

資料與方法

2006年4月～2011年5月收治生理性腹瀉患兒68例，男30例(44.1%)，女38例(55.9%)。＜1個(gè)月患兒38例(55.9%)，1～4個(gè)月患兒23例(33.8%)，4～6個(gè)月患兒7例(10.3%)，期中純母乳喂養(yǎng)患兒54例(79.4%)，混合喂養(yǎng)13例(19.1%)，人工喂養(yǎng)1例(1.47%)?；純罕憩F(xiàn)多為生后1周左右開始出現(xiàn)腹瀉，每天大便次數(shù)多，甚至十幾次，大便稀黃，呈蛋花洋或者黏液稀便，每次大便量不一定很多，其中含少量水分，并有酸奶味，一般沒有特殊腥臭味，患兒多伴有腹脹，排氣多，多不影響食欲及生長發(fā)育，多數(shù)病例大便常規(guī)多次均未檢出白細(xì)胞、紅細(xì)胞，個(gè)別病例白細(xì)胞＜3個(gè)/HP，脂肪球若干個(gè)，糞便細(xì)菌培養(yǎng)均為陰性。

治療方法：所有病例均采用復(fù)方胃蛋白酶散聯(lián)合寶樂安治療。①＜1個(gè)月：復(fù)方胃蛋白酶散0.5g/次，2次/日。寶樂安0.25g/次，2次/日。②1～4個(gè)月：復(fù)方胃蛋白酶散0.5g/次，3次/日。寶樂安0.25g/次，3次/日。③4～6個(gè)月：復(fù)方胃蛋白酶散0.6g/次，3次/日。寶樂安0.375g/次，3次/日。用溫開水送服，療程2周，用藥后由專人負(fù)責(zé)復(fù)查，并記錄用藥后3天、7天、14天腹瀉癥狀的演變恢復(fù)(腹瀉次數(shù)、大便性狀、是否腹脹以及用藥后有無不良反應(yīng))。

療效判斷標(biāo)準(zhǔn)：①顯效：治療3天糞便性狀及次數(shù)恢復(fù)正常，全身癥狀消失；②有效：治療7天糞便性狀及次數(shù)明顯好轉(zhuǎn)，全身癥狀明顯改善；③無效：治療14天糞便性狀、次數(shù)及全身癥狀均無好轉(zhuǎn)，甚至惡化。總有效率為顯效+有效。

結(jié) 果

結(jié)果顯示，治療3天后總有效率89.7%，7天總有效率92.6%，14天總有效率97.1%。治療效果，見表1。

討 論

生理性腹瀉多見于6個(gè)月以下的嬰兒，其外觀虛胖，常有濕疹，出生后不久即腹瀉，每天大便次數(shù)多，甚至十幾次，每次大便量不一定很多，其中含少量水分，一般沒有特殊腥臭味。生理性腹瀉的嬰兒除大便次數(shù)增多外，多無其他癥狀，食欲好，無嘔吐，生長發(fā)育不受影響，添加輔食后，大便即逐漸轉(zhuǎn)為正常。嬰兒的消化能力有一定的限度，如果給嬰兒吃的食物超過其承受能力，就會(huì)發(fā)生腹瀉。比如，將牛奶里的水分蒸發(fā)掉一半，制成所謂蒸發(fā)奶，然后用這種奶不加稀釋地喂養(yǎng)嬰兒，就可能有部分嬰兒因奶內(nèi)營養(yǎng)成分太高而發(fā)生腹瀉。母乳的成分由于民族、飲食習(xí)慣、健康狀況以及個(gè)體差異而有很大差別，有的母乳汁內(nèi)含的營養(yǎng)成分不足，造成嬰兒營養(yǎng)不足，而有的母乳汁內(nèi)含的營養(yǎng)成分超過嬰兒的需要，其多余的部分便隨腹瀉而排出體外。如果生理性腹瀉是由人工喂養(yǎng)造成的，那么只要注意調(diào)整喂養(yǎng)習(xí)慣即可；如果生理性腹瀉是由母乳原因造成的，解決的根本辦法就是換奶，當(dāng)改吃牛奶或其他乳品后一般都能奏效，藥物治療是不能解決根本問題的。

復(fù)方胃蛋白酶散是助消化藥，用于小兒積食，食后腹脹：食乳即瀉［2］，大便清稀、綠便：小兒消化不良等。復(fù)方胃蛋白酶散為復(fù)方制劑，主要成分是胃蛋白酶、白術(shù)(土炒)、山藥、雞內(nèi)金、山楂。其組分為每1g含胃蛋白酶活力不得少于32U。復(fù)方胃蛋白酶常用于因食蛋白性食物過多所致的消化不良；炒白術(shù)補(bǔ)氣健脾；炒山藥健脾補(bǔ)血；雞內(nèi)金主治食積不化，消化不良，小兒疳積：山楂消食化積。

寶樂安其有效成分東海酪酸菌-CGMCC0313-1菌株［3］，可以分泌腸黏膜再生和修復(fù)的重要營養(yǎng)物質(zhì)酪酸，修復(fù)受損傷的腸黏膜，消除炎癥，營養(yǎng)腸道。并能促進(jìn)雙歧桿菌等腸道有益菌的生長，抑制痢疾志賀氏菌等腸道有害菌的生長，恢復(fù)腸道菌群平衡，減少胺、氨、吲哚等腸道毒素的產(chǎn)生及對腸黏膜的損害，恢復(fù)腸道免疫功能和正常的生理功能。同時(shí)，還可以分泌多種促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的酶以及多種維生素類有益物質(zhì)。

復(fù)方胃蛋白酶散與寶樂安聯(lián)合治療嬰兒生理性腹瀉，無配伍禁忌，促進(jìn)消化，補(bǔ)充腸道有益菌，患兒用藥3天療效明顯，療程達(dá)2周效果更佳顯著，具有顯著的協(xié)同作用。

參考文獻(xiàn)

1 沈曉明,王衛(wèi)平.兒科學(xué).北京:人民衛(wèi)生出版社,2008.

篇4

關(guān)鍵詞：胃排空功能；胃蛋白酶；缺氧誘導(dǎo)因子-1α；萎縮性胃炎；香砂六君子湯；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.011

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）01-0047-05

Effects of Xiangsha Liujunzi Decoction on Gastric Emptying Function， Pepsin Activity and Expression of HIF-1α in Chronic Atrophic Gastritis of Rats with Deficiency Spleen and Stomach DUAN Yun-yan1，2， CHENG Ying-xia1，2， WANG Qiang1， LI Lan-zhen2， WANG Qing-sheng1， ZHENG Shi-duo2， LU Peng-cheng2， LEI Zuo-han3， LIU Xue-song1， LIU Zhen-hua1 （1. Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730020， China； 2. Key Laboratory of Traditional Chinese Herbs and Prescription Innovation and Transformation of Gansu Province， Lanzhou 730020， China； 3. Gansu Chinese Medicine Hospital， Lanzhou 730020， China）

Abstract： Objective To study effects of Xiangsha Liujunzi Decoction （XSLJZ） on gastric emptying function， pepsin activity and expression of HIF-1α gene and protein of gastric mucosa in chronic atrophic gastritis （CAG） of rats with deficiency of spleen and stomach. Methods Rats were randomly divided into normal group and model group. The models of CAG rats with deficiency of spleen and stomach type were induced by synthetic methods. After the modeling， models rats were divided into model group， positive control group and XSLJZ high-， medium-， and low-dose groups. Normal group and model group were given 10 mL/kg distilled water every day for gavage； XSLJZ high-， medium-， and low-dose groups were given 24， 12， and 6 g/kg XSLJZ Decoction for gavage； positive control

group was given 0.30 g/kg Vatacoenayme for gavage， for successive 120 d. Gastric emptying function and pepsin activity were detected， and HIF-1α gene and protein expression in gastric mucosa were detected by RT-qPCR and IHC. Results Compared with the normal group， the gastric emptying function and pepsin activity in the model group were much lower （P

Key words： gastric emptying function； pepsin； HIF-1α； atrophic gastritis； Xiangsha Liujunzi Decoction； rats

慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）作為消化系統(tǒng)常見病，尤其在CAG伴有腸上皮化生和異常增生時(shí)，易引起繼發(fā)性胃癌，嚴(yán)重威脅生命質(zhì)量。就其臨床病癥特點(diǎn)而言，中醫(yī)認(rèn)為CAG多以脾胃虛弱、氣機(jī)或氣血失調(diào)為主要病機(jī)，故治療多以健脾益氣、理氣和胃為大法。香砂六君子湯出自《古今名醫(yī)方論》。臨床應(yīng)用顯示，香砂六君子湯及其加減方治療CAG療效顯著[1-2]。本研究通過觀察香砂六君子湯對脾胃虛弱型CAG大鼠胃排空功能、胃蛋白酶活性及胃竇黏膜缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）基因和蛋白表達(dá)的影響，探討該復(fù)方防治CAG的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

2月齡SPF級(jí)健康Wistar大鼠54只，體質(zhì)量（160±10）g，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（甘）2011-0001-0001010。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)，濕度45%～55%，室溫（23±2）℃，喂養(yǎng)滅菌標(biāo)準(zhǔn)飼料和消毒純凈水，自由飲水進(jìn)食。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理相關(guān)程序遵守中國國家健康與醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)動(dòng)物道德準(zhǔn)則，并得到甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 藥物

香砂六君子湯以人參、白術(shù)、茯苓、陳皮、姜半夏、炒砂仁、木香、生姜、甘草按6∶12∶12∶5∶6∶5∶2∶12∶4比例配制（飲片均購自蘭州復(fù)興厚中藥材有限責(zé)任公司，并經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥生藥學(xué)教研室楊扶德教授鑒定合格），第1次加10倍量蒸餾水浸泡2 h后，按常法煎煮2次，每次40 min，濾出藥液加熱濃縮至每1 mL藥液含原藥材2 g，冷卻后置4 ℃冰箱備用，使用時(shí)稀釋至所需濃度；維酶素片，新鄉(xiāng)恒久遠(yuǎn)藥業(yè)有限公司，0.2 g/片，批號(hào)20140108。

1.3 主要試劑與儀器

脫氧膽酸鈉，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司，批號(hào)SLBC0243V；吲哚美辛，上海信誼黃河制藥有限公司，批號(hào)120702；氨水，白銀良友化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)120102；乙醇，天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)120100107；考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒（批號(hào)20140813）、胃蛋白酶測定試劑盒（批號(hào)20140821），南京建成生物科技有限公司；β-actin、HIF-1α引物，寶生物工程（大連）有限公司；Trizol試劑（批號(hào)AK7208-1）、反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒（批號(hào)0000036802），Promega Corporation；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L），批號(hào)ZB-2301，北京中杉金橋生物科技有限公司；Anti-HIF-1α antibody（批號(hào)B3301），美國ImmunoWay公司。DF110型電子分析天平，江蘇常熟衡器工業(yè)公司；XYJ80-2離心機(jī)，廣東塘廈駿越機(jī)電設(shè)備廠；HH-4數(shù)顯恒溫水浴箱，江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所；Benchmark Plus酶聯(lián)免疫檢測儀、BIOMATE 3S核酸蛋白測定儀、S1000TM逆轉(zhuǎn)錄儀、Chemi DOC XRS凝膠成像分析系統(tǒng)、CFX96TM Optics Module PCR儀，美國BIO-RAD公司；BX51/BX52型Olympus系統(tǒng)顯微鏡，日本Olympus公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模與分組

除空白組8只大鼠正常飼養(yǎng)不予造模外，其余46只大鼠參照文獻(xiàn)[3]方法造模。造模組采用復(fù)合慢性損傷因素聯(lián)合作用：①60%乙醇，每3 d空腹灌胃1次（前1 d晚上撤除飼料），每次8 mL/kg；②20 mmol/L脫氧膽酸鈉灌胃，每日1次，每次8 mL/kg；③每日配制0.1%氨水作為大鼠日常飲用水自由飲用，并記錄每日飲用量；④0.05%吲哚美辛灌胃，每日1次，每次8 mL/kg；⑤采用饑飽失常喂養(yǎng)法：2 d足量喂養(yǎng)，1 d禁食。連續(xù)造模40周。待綜合法造模30周時(shí)，每隔1周隨機(jī)抽檢大鼠，取胃黏膜組織做病理檢查并判定胃黏膜萎縮病理變化，評價(jià)CAG模型大鼠胃黏膜萎縮病理形成后開始治療。將CAG大鼠按體質(zhì)量編號(hào)，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、陽性對照組和香砂六君子湯高、中、低劑量組，每組8只。

2.2 給藥

香砂六君子湯高、中、低劑量組每日分別給予24、12、6 g/kg香砂六君子湯藥劑灌胃（相當(dāng)于60 kg成人劑量的12、6、3倍）；對照組每日給予0.30 g/kg維酶素藥劑灌胃（相當(dāng)于60 kg成人劑量的6倍），等效劑量按人與動(dòng)物系數(shù)折算[4]。連續(xù)給藥120 d。每日給藥體積為10 mL/kg?？瞻捉M和模型組給予等量蒸餾水灌胃。

2.3 標(biāo)本采集與檢測

胃排空率實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[5]方法，于末次給藥后禁食不禁水24 h后，分別隨機(jī)抽取各組大鼠8只，給予半固體營養(yǎng)糊2 mL，30 min后用烏拉坦1 g/kg麻醉采血后，迅速打開腹腔，結(jié)扎幽門和賁門后取出胃，清除胃表面的血漬，第1次稱重（胃總重），后剪開胃體，洗去胃內(nèi)容物，用濾紙吸干水分第2次稱重（胃凈重），計(jì)算胃排空率[1-（胃總重-胃凈重）÷所給糊重×100%]。胃黏膜組織勻漿制備：麻醉處死后低溫條件下快速剖取胃黏膜組織，以冰冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱重后用眼科小剪刀盡快剪碎，置于勻漿器中，用組織重9倍生理鹽水勻漿，3500 r/min離心10 min，取上清液，置4 ℃冰箱保存，待測胃組織蛋白酶活性。

2.4 胃黏膜組織缺氧誘導(dǎo)因子-1α基因表達(dá)檢測

取適量胃竇組織，用Trizol法抽提總RNA：將保存于-80 ℃冷凍冰箱中各組大鼠胃竇組織稱取50 mg組織塊置于研缽中，加入1 mL Trizol，研磨均勻，于冰上孵育 5 min 后，4 ℃、12 000×g離心5 min；移入離心管中，冰上孵育5 min后加0.2 mL氯仿，震蕩后4 ℃、12 000×g離心15 min，取上清液移至新離心管，加0.5 mL異丙醇，震蕩，冰上孵育10 min后，4 ℃、12 000×g離心 10 min，棄上清液，RNA沉于管底。向沉淀中加入 1 mL 75%乙醇，震蕩后4 ℃、8000×g離心10 min，棄上清液后室溫下干燥，加入 50 μL DEPC 處理水溶解RNA。核酸定量分析儀測定其OD260/OD280均在1.8～2.0之間，經(jīng)總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測符合純度要求，可用于后續(xù)PCR。

香砂六君子湯出自《古今名醫(yī)方論》，主治因脾胃虛弱，氣機(jī)阻滯，痰濁、濕毒內(nèi)生而生“痞滿”之效方，亦是體現(xiàn)“健脾理氣和胃”治則治法的經(jīng)典方劑。方中人參補(bǔ)中益氣，健脾養(yǎng)胃；白術(shù)健脾燥濕；茯苓健脾滲濕；白術(shù)、茯苓合用，能增強(qiáng)健脾除濕功能，促進(jìn)脾胃運(yùn)化；木香、砂仁芳香健脾和胃，理氣消痞而止痛；陳皮、姜半夏燥濕化痰，理氣降逆；甘草調(diào)胃和中，具有補(bǔ)脾和胃、緩急止痛、調(diào)和諸藥作用。本方是中醫(yī)臨床治療CAG的有效方劑。

中醫(yī)認(rèn)為，脾（胃）主司運(yùn)化水谷，主要涉及機(jī)體消化吸收功能。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病理生理學(xué)的角度分析，正常胃黏膜具有分泌胃酸和胃蛋白酶的功能以促進(jìn)攝入物質(zhì)的初步消化和排空，而CAG患者常因胃黏膜慢性炎性反應(yīng)，組織充血水腫而胃動(dòng)力障礙，或因壁細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，胃黏膜腺體發(fā)生不同程度萎縮，常伴有分泌功能降低[9]，臨床則出現(xiàn)納呆少食、運(yùn)化遲滯、噯氣胃脹等消化功能障礙的典型癥狀。胃蛋白酶是由胃黏膜主細(xì)胞所分泌并存在于胃液中的一種消化性蛋白酶，具有促進(jìn)機(jī)體消化食物的功能。研究表明，CAG患者因胃腺體細(xì)胞發(fā)生不同程度的萎縮，其胃液分泌量和胃蛋白酶減少，同時(shí)因胃液pH值改變，胃蛋白酶的活性亦減弱，進(jìn)而導(dǎo)致胃體化學(xué)消化功能降低，從而出現(xiàn)納呆少食、運(yùn)化遲滯及胃脘脹滿之證[10]。同時(shí)從病理學(xué)角度分析，CAG病程中主要存在胃黏膜慢性炎性反應(yīng)及不典型增生等變化，而且HIF-1α與慢性炎性反應(yīng)的關(guān)系密切。HIF-1α是廣泛存在于機(jī)體細(xì)胞中的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[11]，該基因由低氧誘導(dǎo)并介導(dǎo)細(xì)胞對缺氧微環(huán)境進(jìn)行適性反應(yīng)，缺氧時(shí)HIF-1α表達(dá)顯著上調(diào)[12]，由此啟動(dòng)60余種下游因子的轉(zhuǎn)錄以使細(xì)胞逐漸適應(yīng)有氧到缺氧的轉(zhuǎn)變，而且HIF-1α與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，多種致炎細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α、前列腺素E2及脂多糖均能激活HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性[13]，參與創(chuàng)傷修復(fù)重塑及炎癥等過程。

本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠一般生存情況較差，胃排空功能、胃蛋白酶活性顯著降低，而HIF-1α基因和蛋白表達(dá)水平顯著升高，說明大鼠CAG病程中存在胃排空功能紊亂，胃蛋白酶活性下降，而且因胃黏膜組織萎縮、炎性病變表現(xiàn)為缺氧條件下黏膜組織中HIF-1α基因和蛋白高表達(dá)；經(jīng)藥物治療后并與模型組比較，香砂六君子湯組大鼠胃排空功能、胃蛋白酶活性顯著升高，HIF-1α基因和蛋白表達(dá)下調(diào)，且以香砂六君子湯高劑量作用顯著，提示香砂六君子湯通過調(diào)節(jié)胃排空功能，促進(jìn)胃蛋白酶活性、下調(diào)缺氧環(huán)境中胃黏膜組織HIF-1α基因和蛋白表達(dá)的途徑以防治脾胃虛弱型CAG。

參考文獻(xiàn)：

[1] 高艷.加味香砂六君子湯治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的臨床觀察[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2011，22（5）：1283-1284.

[2] 白冬梅.香砂六君顆粒對慢性胃炎伴腸化生和不典型增生的療效觀察[J].實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2011，25（1）：49-50.

[3] 姒健敏，吳加國，曹倩，等.鼠慢性萎縮性胃炎模型的建立及致萎縮因素探討[J].中華消化雜志，2001，21（2）：75-77.

[4] 陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1993：33-34.

[5] 王松坡，張存鈞，竇丹波.消痞方對功能性消化不良大鼠胃排空、血漿胃動(dòng)素的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2004，11（10）：1060-1061.

[6] 姚梅蘭.香砂六君子湯加味治療慢性萎縮性胃炎68例[J].江蘇中醫(yī)藥，2012，44（7）：37-38.

[7] 李冀，李浦媛，劉波.香砂六君子湯的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥信息， 2008，25（2）：33-34.

[8] 李維柏.香砂六君子湯加減治療慢性萎縮性胃炎臨床觀察[J].四川中醫(yī)，2009，27（8）：88.

[9] 陳佳，李守英，徐紅.慢性萎縮性胃炎的研究進(jìn)展[J].中國老年學(xué)雜志，2013，33（14）：3540-3542.

[10] 畢B輝，楊天仁.香砂六君子湯及其拆方對脾虛胃潰瘍模型大鼠胃蛋白酶、SOD、MDA水平的影響[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，26（4）：280- 281.

[11] CHAN D A， SUTPHIN P D， DENKO N C， et al. Role of poly hydroxylation in oncogenically stabilized hypoxia-inducible factor-1α[J]. Biol Chem，2002，277（42）：40112-40117.

[12] CRAMER T， YAMANISHI Y， CLAUSEN B E， et al. HIF-1alpha is essential for myeloid cell-mediated inflammation[J]. Cell，2003，112（5）：645-657.

篇5

關(guān)鍵詞：中性蛋白酶：復(fù)合蛋白酶；水解度：固定化酶；苦味值

中圖分類號(hào)：TQ936.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-979X(2010)09-0305-03

用蛋白酶催化水解蛋白質(zhì)，可提高其溶解性和熱穩(wěn)定性，防止酸沉淀，還可以改進(jìn)食品的風(fēng)味。蛋白質(zhì)水解物可用于各類食品和方便食品調(diào)味料中。酶法水解蛋白質(zhì)具有效率高、條件溫和、營養(yǎng)成分不破壞等優(yōu)點(diǎn)，是目前國內(nèi)外用于食品生產(chǎn)的主要方法。但酶法水解蛋白質(zhì)會(huì)產(chǎn)生主要由疏水氨基酸組成的小分子多肽，有苦味，影響了產(chǎn)品的口感。目前國內(nèi)食品企業(yè)主要使用丹麥諾維信公司的復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味酶，用國產(chǎn)酶制劑生產(chǎn)的蛋白質(zhì)水解物苦味較重。用低成本工藝生產(chǎn)水解度高的低苦味或無苦味的蛋白質(zhì)水解物，是目前急需解決的問題。固定化酶具有穩(wěn)定性好，帶入雜質(zhì)少等優(yōu)點(diǎn)，僅需簡單過濾即可重復(fù)使用，可降低生產(chǎn)成本。本研究以酪蛋白為實(shí)驗(yàn)材料，用固定化蛋白酶制備蛋白質(zhì)水解物，探索水解度高、苦味少、成本低、雜質(zhì)少，能達(dá)到食品工業(yè)質(zhì)量要求的蛋白質(zhì)水解物制備方法。

1材料

中性蛋白酶(neutral protease，NP)從本實(shí)驗(yàn)室保藏的產(chǎn)蛋白酶菌株提?。粡?fù)合蛋白酶(protamex，PM)丹麥諾維信公司產(chǎn)；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

2方法

2.1溶液配制

酪蛋白溶液：取酪蛋白5 g，加蒸餾水60 mL，3 mol／L氫氧化鈉1.8 mL，沸水浴加熱至溶解，調(diào)pH 7.0，定容至100 mL：茚三酮溶液：取茚三酮1.0 g，果糖0.06 g，用95％乙醇溶解并定容到100 mL：三氯乙酸溶液：取三氯乙酸1.8 g，無水乙酸鈉2.99 g，冰乙酸1.89 mL，加蒸餾水溶解并定容至100 mL。

2.2固定化載體的制備

取殼聚糖1.0 g，加蒸餾水200 mL，冰乙酸4 mL，37℃振蕩4 h至溶解。調(diào)pn 7.0，析出殼聚糖，加25％戊二醛2 mL，37℃振蕩反應(yīng)4 h，所得活化殼聚糖用蒸餾水充分洗滌15次以上，吸干水分后于－20℃保存。

2.3固定化酶的制備

活化殼聚糖加蛋白酶溶液，30℃振蕩反應(yīng)30 min后，離心去上清，沉淀用蒸餾水洗滌10次以上，得固定化酶。

2.4酶活性測定

取5％酪蛋白0.0 mL，加入酶液100 gL，50℃振蕩反應(yīng)10 min，加入900 p_L三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，離心后取上清測A275，計(jì)算酶活性。

固定化酶活性回收率(％)=固定化酶總活性／游離酶總活性×100％。

酶活性定義：在上述反應(yīng)條件下，每1 min產(chǎn)生的氨基酸和肽的A275增加值相當(dāng)于1ug酪氨酸A所需的酶量為1個(gè)酶活性單位(u)。

2.5苦味值的評定

參考陶紅等的方法，蛋白質(zhì)水解液由有經(jīng)驗(yàn)者品嘗，評定結(jié)果分為1～5級(jí)，順序?yàn)椋簾o苦味，微苦，較苦，苦，很苦。

2.6蛋白質(zhì)水解度(degreeofhydrolysis，DH)的測定

取蛋白質(zhì)水解液100ul(以未水解蛋白質(zhì)溶液為對照)，加磷酸氫二鈉.檸檬酸緩沖液(pH 5A)800ul，茚三酮100ul，混勻后沸水浴加熱15 nm，冷卻15 nlh后測A，參考趙新淮等的方法計(jì)算DH。

3結(jié)果與分析

3.1固定化酶活性回收率

取活化殼聚糖0.15g，加入NP 1 mL(2580U／mL)，反應(yīng)后分別測定上清液和固定化酶的酶活性。結(jié)果表明，上清液剩余酶活性為14.2％，固定化中性蛋白酶(INP)酶活性回收率為59.9％；取活化殼聚糖0.2 g，加入PM l mL(2 360U／mL)，反應(yīng)結(jié)果表明，上清液剩余酶活性為23.8％，固定化復(fù)合蛋白酶(IPM)酶活性回收率為35.0％(圖1)。上清液剩余酶活性和固定化酶活性之和低于出發(fā)酶液的總活性，可能是因固定化酶受空間結(jié)構(gòu)限制，不能與底物自由接觸；IPM酶活性回收率很低，可能是因諾維信PM由多種不同的酶組成，其中某些酶不能被活化殼聚糖固定。

3.2固定化酶的穩(wěn)定性

50℃下用固定化酶分解5％酪蛋白10 h。離心回收固定化酶，洗滌后再重復(fù)使用9次。結(jié)果表明，使用10次后INP和IPM的酶活性仍分別保存70.0％和79.8％，表明2種固定化酶都具有較高的穩(wěn)定性。

3.3固定化酶法制備低苦味蛋白質(zhì)水解物

3.3.1用INP和IPM制備低苦味蛋白質(zhì)水解物分別取1NP O.15，0.30，0.45，0.60 g和IPM 0.8，1.2，1.6，2.0，4.0 g，分別加5％酪蛋白10mL，50℃反應(yīng)6h，離心取上清，測DH。結(jié)果表明，蛋白質(zhì)水解物的DH隨固定化酶用量增加而增加，其中用INP制備，DH快速增加，可達(dá)到26.5％(圖2)，苦味值2級(jí)：用IPM制備，DH增加緩慢，低于10％(圖3)，苦味值4級(jí)；用IPM制備，DH和苦味值的質(zhì)量指標(biāo)均較低，可能是因IPM中只有諾維信復(fù)合蛋白酶的一部分，固定化的酶中還有一部分未充分表現(xiàn)其活性，所以酶切位點(diǎn)大量減少。

3.3.2比較用INP和游離PM制備的低苦味蛋白質(zhì)水解物取INP 0.45 g和PM 50 mg，分別加5％酪蛋白10 mL，于50℃反應(yīng)1，2，4，6，8 h，離心，測上清水解度。結(jié)果表明，DH隨著反應(yīng)時(shí)間的延長而增加，INP制備的蛋白質(zhì)水解物的DH快速增加，游離PM制備蛋白質(zhì)水解物的DH緩慢增加(圖4)，反應(yīng)8h后兩者DH都達(dá)到25％，苦味值都是2級(jí)，但后者的苦味稍低于前者。表明用INP和游離PM制備所得蛋白質(zhì)水解物的DH和苦味值基本相同。

4討論

篇6

【關(guān)鍵詞】 尿NAG;mALB;α1-MG;β2-MG;糖尿病腎病;診斷價(jià)值

糖尿病腎病(Diabeticnephropathy,DN)是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一,也是糖尿病致死的重要原因,早期無明顯的癥狀和體征。糖尿病對腎小球、腎小管的損傷一直是糖尿病腎病研究的重點(diǎn)[1]。約30%～40%的1型糖尿病和5%～20%的2型糖尿病患者在病程高達(dá)10～15年間發(fā)生糖尿病腎病,因此糖尿病腎病的早期診斷是防止DN的關(guān)鍵[2]。本文通過檢測2型糖尿病患者尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)、尿微量白蛋白(mALB)、尿β2-微球蛋白(β2-MG)、尿α1-微量球蛋白(α1-MG)的含量,以探討對DN的早期診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將95例受試者分為健康對照組(為門診健康體檢人群)和病例組(均為2型糖尿病患者)。健康對照組55例,男25例,女30例。年齡19～70歲,平均(43.4±14.4)9歲,均已證實(shí)無糖尿病、腎臟疾病及其他內(nèi)分泌疾病。病例組40例,按世界衛(wèi)生組織(WHO)診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]確診的2型糖尿病患者,男31例,女9例,年齡39～71歲,平均(48.8±9.81)歲。

1.2 標(biāo)本收集 所有入選本組實(shí)驗(yàn)者均留取新鮮晨尿10 ml,以1500 r/min離心5 min后取上清液進(jìn)行檢測。

1.3 儀器、試劑及檢測方法 選用的儀器為“上海棱光技術(shù)有限公司”生產(chǎn)的S22PC可見分光光度儀、“北京普朗有限公司”生產(chǎn)的9602-DNM酶標(biāo)分析儀。檢測項(xiàng)目的試劑盒均由“上海德波生物有限公司”提供。尿NAG測定采用對硝基苯酚(PNP)比色法檢測,尿mALB、β2-MG、α1-MG測定均采用酶聯(lián)免疫法檢測。檢測結(jié)果的判斷:尿NAG>15.7 U/L、mALB>20 mg/L、β2-MG>0.30 mg/L、α1-MG>15 mg/L均為陽性結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 資料處理使用Excel2003中文版將回收的資料建立數(shù)據(jù)庫,運(yùn)用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。統(tǒng)計(jì)描述:計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)、百分比;計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示;統(tǒng)計(jì)推斷:連續(xù)性變量先進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn),不符合正態(tài)分布的變量采用Log10轉(zhuǎn)化后使其符合正態(tài)分布后再進(jìn)行分析;然后進(jìn)行t檢驗(yàn)及Logistic多元回歸分析。采用雙側(cè)檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 病例組四項(xiàng)指標(biāo)陽性率明顯高于健康對照組。病例組尿NAG異常38例(95.0%);尿ALB異常32例(84.2%);尿α1-MG異常20例(50.0%);尿β2-MG異常19例(47.5%)。尿NAG陽性率最高。兩組各指標(biāo)檢測結(jié)果見表1。

2.2 病例組四項(xiàng)檢測指標(biāo)高于健康對照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,(P

2.3 是否有早期DN為因變量,尿NAG、mALB、β2-MG、α1-MG為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析,結(jié)果尿NAG進(jìn)入方程,其敏感性最高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

表1

兩組四項(xiàng)指標(biāo)檢測結(jié)果比較的陽性率(例,%)

組別例數(shù)NAGmALb β2-MG α1-MG

健康對照組551(1.8)0(0)0(0)0(0)

住院病例組4038(95.0)32(84.2)19(47.5) 20(50.0)

DOI:10.3760/cma.j.issn 1673-8799.2010.04.93

作者單位:830001烏魯木齊市人民醫(yī)院腎病研究室

表2

健康對照組與病例組之間四項(xiàng)指標(biāo)水平比較(x±s)

組別例數(shù) Lg10 NAGLg10 (mALb×10)Lg10(β2-MG×10) Lg10α1-MG

健康對照組55 0.95±0.2542.85±0.394 0.82±0.323 0.73±0.283

病例組40 1.58±0.286 4.31±0.837 1.48±0.5241.28±0.339

P值

表3

Logistic多元回歸模型分析

項(xiàng)目 BOR95%CIP值

Lg10 NAG14.952 3.12×106 20.474-4.74×1011 0.014

Lg10 (mALb×100)1.3033.6810.384-35.2970.259

Lg10(β2-MG×100) 0.411 1.5080.104-21.8570.763

Lg10α1-MG 4.361 78.316 0.284-2.16×1040.128

2.4 ROC曲線、診斷試驗(yàn) LgNAG確診早期DN,曲線下面積為0.972,95%可信區(qū)間是0.932～1.001(P

表4

項(xiàng)目 曲線下面積95%CIP值

LgNAG0.972 0.932-1.011

圖1

3 討論

DN是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥,是糖尿病患者死亡的重要原因之一。能夠早期發(fā)現(xiàn)DN,對于臨床早期治療有一定意義。NAG為大分子糖蛋白,相對分子量為(130～140)×103,腎臟是合成和存儲(chǔ)NAG的主要器官,血漿中半衰期僅為5 min,且血漿中的NAG不能被腎小球?yàn)V過。當(dāng)近端腎小管受損時(shí)NAG活性明顯增高,預(yù)示近端腎小管上皮細(xì)胞受損,溶酶體破裂釋放NAG,因此尿NAG是反映腎小管損害的敏感且特異的指標(biāo)[4]。尿mALb正常情況下腎小球?yàn)V過膜存在電荷選擇屏障的靜電同性排斥作用,尿mALb不能通過腎小球?yàn)V過膜,而各種炎性反應(yīng)、代謝異常和免疫損傷均可導(dǎo)致濾過膜上負(fù)電荷減少,靜電排斥力下降,造成尿mALb從尿中漏出增多,是早期腎損傷的敏感指標(biāo)[5]。正常人體內(nèi)的β2-MG的生成和釋放速度是非常恒定的,且能自由通過腎小球?yàn)V過膜。原尿中的99.9%的β2-MG可被近端腎小管上皮細(xì)胞重吸收和降解。當(dāng)腎近曲小管輕微受損時(shí),對β2-MG的重吸收下降,尿β2-MG含量就增加,當(dāng)腎臟損傷影響到腎小管重吸收功能時(shí)尿β2-MG升高[5]。α1-MG為人體內(nèi)的一種糖蛋白,較廣泛存在于人的體液中。健康狀況下,體液中的α1-MG可自由通過腎小球?yàn)V膜,在近曲小管吸收或代謝。據(jù)報(bào)道[6],腎小管重吸收的功能下降1%時(shí),尿中β2-MG的排出量可增加30%,α1-MG也有所升高。當(dāng)發(fā)生糖尿病腎病時(shí),β2-MG、α1-MG均升高,其升高幅度與腎功能受損程度相關(guān)。尿mALB檢測是較公認(rèn)的糖尿病腎病早期診斷的指標(biāo)之一,但由于其對腎小管損傷診斷不敏感,不可避免地存在著漏檢漏診現(xiàn)象。目前逐漸認(rèn)識(shí)到糖尿病不僅會(huì)累及腎小球,還會(huì)累及腎小管間質(zhì)結(jié)構(gòu),且腎功能惡化的程度與腎小管間質(zhì)纖維化程度密切相關(guān),腎臟病的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后轉(zhuǎn)歸過程中,腎小管間質(zhì)損害起著極其重要的作用[6]。糖尿病時(shí)腎小管的損傷先于腎小球的損傷[7],在糖尿病損害早期,腎小球?yàn)V過壓增高,濾過膜負(fù)電荷減少和裂孔變化使蛋白質(zhì)濾出增加,使溶酶體激活,導(dǎo)致尿NAG升高,并隨病程的延長損傷率上升[8] 。本文資料表1、表2顯示:病例組四項(xiàng)指標(biāo)陽性率及檢測含量明顯高于健康對照組,病例組陽性率分別為尿NAG(95.0%);尿ALB(84.2%);尿α1-MG(50.0%);尿β2-MG(47.5%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

參考文獻(xiàn)

[1] 錢榮麗.WHO專家咨詢報(bào)告:糖尿病的定義診斷、分型與糖尿病并發(fā)癥.中國糖尿病雜志,2000,8(15)5.

[2] 董林.隨意微量白蛋白在早期糖尿病腎病診斷中的價(jià)值.放射免疫學(xué)雜志,2007,20(5):440.

[3] Wolf G. CeLL cycle regulation in diabetic nephropathy. Kidney Int,2000,58(supp177):S59-S66.

[4] Mohammadi-KarakaniA,Asgarzadeh-HaghighiS,Gha-zi-khansariM,et al.Determination of urinary enzymes as a markers of early renal damage in diabetic patients.J clin Lab Anal,2007,21(6):413-417.

[5] 林青,阮詩緯,許少鋒,等.尿微量蛋白聯(lián)合尿酶診斷腎臟早期損傷.中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志,1999,22(1):29-31.

[6] 楊春,許桂秋,張嶺.尿微量蛋白檢測對糖尿病腎病早期診斷的臨床意義.標(biāo)記免疫分析與臨床,2002,9(1):56-57.

篇7

主要從四個(gè)方面來分析：

第一，成本。根據(jù)公開資料顯示，摩拜的單車成本大約3 000元/輛，而ofo的單車成本含維護(hù)大約270元/輛。

在客單價(jià)上，摩拜的收費(fèi)為1元/30分鐘。如果作為城市公共交通末梢和微循環(huán)的自行車出行場景，即500米到3千米的騎行距離，客單價(jià)在2元以內(nèi)。ofo校內(nèi)0.01元/分鐘，0.04元/千米，校內(nèi)客單價(jià)大約在0.1元以內(nèi)。在校外，ofo雙號(hào)牌的車，收費(fèi)是0.04元/分鐘，0.16元/公里，客單價(jià)大約在0.5元。

結(jié)合單車成本和客單價(jià)，排除天氣等原因，假設(shè)實(shí)際出行為300天，每輛摩拜單車的使用頻率1天5次，大約1年可以收回成本。由于學(xué)生單車出行的習(xí)慣比較普遍，假設(shè)ofo每天使用頻率大約10次，那一輛ofo大約270天就能收回成本。

第二，覆蓋密度。這是ofo真正凸顯成本優(yōu)勢的地方。如果尋車的距離在500米以上，尋車時(shí)間超過6分鐘，人們對騎車接駁公共交通的需求將大幅下降。為了確保500米范圍內(nèi)有車，則需要對城市運(yùn)營區(qū)域內(nèi)500米半徑對應(yīng)的每0.79平方千米的面積進(jìn)行覆蓋。按廣州市環(huán)城高速內(nèi)人口密度20 000人/平方千米計(jì)算，假設(shè)每100人中1人選擇騎車，在廣州環(huán)城高速210.13平方千米的范圍內(nèi)，則需運(yùn)營42 025輛自行車。假設(shè)通過數(shù)據(jù)分析優(yōu)化調(diào)度能夠?qū)崿F(xiàn)20%的自行車滿足80%的需求，那么廣州環(huán)城高速內(nèi)合適的投放量是16 810輛。要實(shí)現(xiàn)這個(gè)投放量，摩拜的成本是5 043萬元，ofo的成本是453.87萬元。

篇8

關(guān)鍵詞 魚鱗；明膠；酶解產(chǎn)物；生物活性

中圖分類號(hào) TS20 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1673-9671-(2012)062-0228-01

魚鱗是有鱗魚加工的主要副產(chǎn)品之一，占魚體重量的1%-5%。目前對魚鱗的開發(fā)利用主要有以下幾個(gè)方面：提取魚鱗膠，作為食品、化妝品等原材料，具有抗氧化和降低血壓、降低血液總膽固醇、抗衰老等功效；制備魚鱗水解液，除水解出大量的氨基酸外還會(huì)產(chǎn)生具有特定功能的肽；提取魚銀，作為一種昂貴的生物試劑，用于珍珠裝飾業(yè)和油漆制造業(yè)；低值淡水魚的魚鱗可用來開發(fā)魚鱗涼粉、魚鱗凍膏、干制魚鱗等食品，制作成各種工藝品；提取卵磷脂；提取鳥嘌呤，用于治療白血病。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

冷凍羅非魚魚鱗；木瓜蛋白酶、胰蛋白酶；胃蛋白酶；酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

真空泵、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；紫外可見分光光度計(jì)；冷凍干燥機(jī)；氨基酸自動(dòng)分析儀；精密增力電動(dòng)攪拌器

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 魚鱗明膠提取

魚鱗50.00 g按照設(shè)定的提取時(shí)間、溫度、液料比提取，經(jīng)鐵篩過濾，濾液用105℃干燥，得到明膠。

2.2 明膠酶解產(chǎn)物活性研究

2.2.1 明膠的酶解

不同蛋白酶對同一底物的水解效果不同，本實(shí)驗(yàn)選用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶分別對明膠進(jìn)行水解。

2.2.2 抗氧化活性的測定

1）羥自由基清除作用。試管中依此加入硫酸亞鐵1mL，水楊酸-乙醇1 mL，樣品1 mL，H2O2 1 mL，將混合液在37℃水浴鍋中反應(yīng)30 min，取出后用分光光度計(jì)在510 nm波長下測定吸光值。

計(jì)算公式為：清除率I（%）=[1-（As-Ao）/Ac ]×100

2）DPPH自由基清除力。試管中加入4 mL樣品，1 mLDPPH-乙醇溶液，充分震蕩后暗室反應(yīng)30min，用分光光度計(jì)在517 nm波長下測定吸光值。（不加樣品加蒸餾水為空白對照，以100 μg/ml的VC作陽性對照）

計(jì)算公式為：DPPH自由基清除率I（%）=（Ac-As）/Ac×100

2.2.3 血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶抑制活性測定

取5ul樣品加入15 ul的ACE酶（37℃ 5 min）后，加入25 ulHHL（三肽馬尿酰-組氨酸-亮氨酸）（37℃ 25 min），再加入0.1%三氟乙酸（TFA）10 ul于16500×g的速度4℃離心20 min后，取上清液在228 nm處紫外光檢測條件下檢測馬尿酸的峰面積。（以緩沖液替代樣品作為空白對照）

計(jì)算公式為：抑制率I（%）=（Ac- As）/Ac×100%

2.2.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

抑制劑活力測定：根據(jù)Tremblay等的方法測定AG的活性，即以pNPG為底物，0.5 mol/L碳酸鈉溶液為終止液。在37℃，pH6.8的條件下反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在405 nm波長處比色測定。

計(jì)算公式為：抑制率I（%）=1-[（As- AB）/Ac×100%]

3 結(jié)果與討論

3.1 抗氧化活性的測定

3.1.1 羥自由基清除作用

六種蛋白酶水解液中，胰蛋白酶水解液和堿性蛋白酶水解液的羥自由基清除力較強(qiáng)分別為76.7%和76.0%，甚至高于VC的65.6%；其次為中性蛋白酶水解液、酸性蛋白酶水解液和胃蛋白酶水解液；而木瓜蛋白酶水解液清除率僅為6.8%。

3.1.2 DPPH自由基清除力

六種蛋白酶水解液中，堿性蛋白酶水解液的DPPH自由基清除力最強(qiáng)為42.2%，低于陽性對照VC的47.7%，其次為胃蛋白酶水解液30.8%和酸性蛋白酶水解液25.6%，再次為胰蛋白酶水解液16.3%和木瓜蛋白酶水解液10.9。中性蛋白酶對DPPH自由基沒有清除能力。

3.2 血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶抑制活性測定

六種蛋白酶水解液中，酸性蛋白酶水解液的ACE抑制率最高為71.7%，其次為木瓜蛋白酶水解液68.9%和堿性蛋白酶水解液68.7%，再次為胰蛋白酶水解液63.9%和中性蛋白酶水解液61.5%，ACE抑制率最低的是胃蛋白酶水解液僅為0.78%。

3.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

六種蛋白酶水解液對AG活性有截然不同的作用。酸性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶對AG有抑制作用，其中胃蛋白酶水解液的抑制率為67.10%，對AG的抑制作用最強(qiáng)。而中性蛋白酶、堿性蛋白酶和胰蛋白酶明膠水解液對AG沒有抑制作用。

4 結(jié)論

六種不同的酶（酸性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶）水解魚鱗明膠，對其生物活性進(jìn)行比較。其中胰蛋白酶水解液和堿性蛋白酶水解液的羥自由基清除力較強(qiáng)分別為76.7%和76.0%，高于VC的65.6%；堿性蛋白酶水解液的DPPH自由基清除力最強(qiáng)42.4%，但不及VC；六種蛋白酶水解液中酸性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶對AG活性有抑制作用，其中胃蛋白酶水解液的抑制作用最強(qiáng)為67.10%；六種酶水解液均有ACE抑制作用，酸性蛋白酶水解液的ACE抑制率最高71.7%。

參考文獻(xiàn)

[1]鐘朝輝,李春美,梁晉鄂等.魚鱗膠原蛋白提取工藝的優(yōu)化[J].食品科學(xué),2006,27(07):162-166.

[2]劉慶慧,王彩理,劉叢力.魚鱗膠原蛋白研究[J].海洋水產(chǎn)研究,2000.

21(3):57-61.

[3]張俊杰,曾慶孝.魚鱗的開發(fā)利用前景[J].中國水產(chǎn),2004,5:74-75.

[4]吳繼魁,張俊玲.草魚魚鱗中提取卵磷脂的最佳工藝[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào)2005,14(4):428-431.

[5]王理彩,劉從力,任紅.魚鱗的加工及利用[J].北京水產(chǎn),2005,1:44-45.

[6]寧正祥.食品成分分析手冊[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,1998:119-143.

[7]Chapdelaine P,Tremblay RR,Dube JY. p-Nitrophenol-α-D-glucopyranoside as substrate for measurement of maltase activity in human semen[J].Clin Chem, 1978, 24(2):208-211.

篇9

【摘要】 目的比較壁虎不同提取工藝成分對S180和H22荷瘤小鼠的抑瘤作用及免疫器官的影響。方法以肉瘤S180、肝癌H22荷瘤小鼠作為動(dòng)物模型，以抑瘤率及胸腺、脾臟指數(shù)為指標(biāo)比較壁虎原粉及水煎煮、胃蛋白酶酶解、胰蛋白酶酶解、仿生酶解等不同工藝成分的抗腫瘤作用。結(jié)果3種酶解工藝成分對肉瘤S180和H22肝癌抑瘤率均明顯高于原粉與水煎煮液，相比模型組有顯著性差異(P

【關(guān)鍵詞】 壁虎; 酶解; 抗腫瘤; S180; H22

壁虎，別名守宮、壁虎、蝎虎、天龍，味咸性寒，功能祛風(fēng)，定驚，散結(jié)，解毒。壁虎作為藥材始見于《本草經(jīng)集注》，而《本草綱目》就稱其能治“瘰疬初起……血積成痞，反胃膈氣，癰瘡大痛”。 其可入血分透筋達(dá)絡(luò)，既善破血散結(jié)解毒，又能通經(jīng)活絡(luò)而止痛。隨著壁虎多種藥理活性，特別是抗腫瘤活性被發(fā)現(xiàn)后[1]， 人們對壁虎的關(guān)注度日益提高。目前壁虎臨床一般以原粉、水煎煮等方法應(yīng)用，存在服用量大、易被微生物污染等缺點(diǎn)?，F(xiàn)代藥理研究表明，動(dòng)物類藥材發(fā)揮作用的主要為其小分子肽[2～4]，因此，我們擬采用酶解方法得到其小分子肽，并與常規(guī)原粉和水煎煮液比較其抗腫瘤作用的差異。

1 材料

1.1 動(dòng)物昆明種小鼠，雄性，體質(zhì)量(20±2)g，購自山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)為：SCXK(魯)20050015。S180腹水小鼠和H22肝癌小鼠均購自山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院。

1.2 儀器JJ-2型組織搗碎機(jī)，江蘇江南儀器廠;搖擺式高速中藥粉碎機(jī)，浙江大德中藥器械有限公司;W-O型恒溫水浴鍋，上海申順生物科技有限公司，TDL-5飛鴿牌離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;小型切向流超濾系統(tǒng)，美國Millipore公司(密理博)。

1.3 試劑及藥品胃蛋白酶(酶活力>1 200 U/g)，胰蛋白酶(酪蛋白轉(zhuǎn)化力≥25.0)，均購自國藥基團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，注射用環(huán)磷酰胺，200 mg/支，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：08051354，氟尿嘧啶注射液(5-Fu)，上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號(hào):080302。壁虎購自濟(jì)南興旺蟾業(yè)，經(jīng)本校周風(fēng)琴教授鑒定系壁虎科動(dòng)物無蹼壁虎Gekko swinhonis Gunther的干燥全體，置干燥箱60℃以下真空干燥，粉碎，過80目篩，細(xì)粉備用。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

2.1.1 原粉液的制備取壁虎細(xì)粉，用0.2%羧甲基纖維素將其稀釋成1 ml∶0.5 g的混懸液，備用。

2.1.2 水煎煮提取液的制備取壁虎細(xì)粉，加8倍量水煮沸煮沸60 min，離心，殘?jiān)?倍量水煮沸30 min，離心，合并上清液，濃縮至1:0.5(每毫升藥液相當(dāng)于0.5 g藥材，下同)，即得水煎煮提取液。

2.1.3 胃蛋白酶酶解液的制備[5]取壁虎細(xì)粉90 g，置于組織搗碎器中，加入5倍量水，勻漿(10 000 r/min)10 min，等分為3份，取1份，煮沸15 min，放冷，調(diào)節(jié)pH 2.0，移至37 ℃恒溫水浴鍋中，保溫10 min，加入1%胃蛋白酶，2 h后取出，離心(4 000 r/min)10 min，取上清液，微濾(0.22 μm)，超濾(相對分子質(zhì)量3 000)，收集相對分子質(zhì)量小于3 000部分，濃縮至1∶0.5，即得胃蛋白酶酶解液。

2.1.4 胰蛋白酶酶解液的制備[6]取“2.1.3”項(xiàng)下一份樣品液，煮沸15 min，放冷，調(diào)節(jié)pH 7.5，移至55 ℃恒溫水浴鍋中，保溫10 min，加入1%胰蛋白酶，3 h后取出，離心(4 000 r/min)10 min，取上清液，微濾(0.22 μm)，超濾(相對分子質(zhì)量3 000)，收集相對分子質(zhì)量小于3 000部分，濃縮至1∶0.5，即得胰蛋白酶酶解液。

2.1.5 仿生酶解液的制備取“2.1.3”項(xiàng)下一份樣品液，煮沸15 min，放冷，調(diào)節(jié)pH 2.0，移至37 ℃恒溫水浴鍋中，保溫10 min，加入1%胃蛋白酶，2 h后取出，調(diào)節(jié)pH 7.5，移至55 ℃恒溫水浴鍋中，保溫10 min，加入1%胰蛋白酶，3 h后取出，離心(4 000 r/min)10 min，取上清液，微濾(0.22 μm)，超濾(相對分子質(zhì)量3 000)，收集相對分子質(zhì)量小于3 000部分，濃縮至1∶0.5，即得仿生酶解液。

2.2 抗腫瘤作用的比較[7]

2.2.1 對S180荷瘤小鼠的影響無菌抽取傳代8 d的S180腹水小鼠腹腔腫瘤細(xì)胞，加入生理鹽水調(diào)整濃度至4×109個(gè)/L，于每只小鼠右腋下注射0.2 ml，接種140只。接種24 h后，將小鼠隨機(jī)分為7組，每組20只，即模型組、原粉組、水煎煮組、胃蛋白酶酶解組、胰蛋白酶酶解組、仿生酶解組與陽性對照組。模型組灌胃生理鹽水10 ml·kg-1，連續(xù)10 d;原粉組、水煎煮組、胃蛋白酶酶解組、胰蛋白酶酶解組、仿生酶解組均5 g藥材·kg-1藥液，連續(xù)10 d;陽性對照組腹腔注射環(huán)磷酰胺，劑量30 mg·kg-1，連續(xù)3 d;給藥量均為10 ml·kg-1。第11天，各組動(dòng)物頸椎脫臼處死，剝離腫瘤、胸腺、脾臟，稱重，計(jì)算抑瘤率、胸腺與脾臟指數(shù)，計(jì)算公式如下：

抑瘤率(%)=(空白組瘤重均值-樣品組瘤重均值)/空白組瘤重均值×100%

胸腺(脾臟)指數(shù)=重量(mg)/體質(zhì)量(g)

2.2.2 對H22荷瘤小鼠的影響建模方法、給藥方式、劑量均同S180荷瘤小鼠(對照組為5-Fu，25 mg·kg-1)。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有測定數(shù)值以±s表示，采用方差分析法進(jìn)行分析，P

3 結(jié)果

3.1 對S180荷瘤小鼠的影響

3.1.1 對S180荷瘤小鼠抑瘤率的影響結(jié)果見表1表1 對S180荷瘤小鼠抑瘤作用的影響

3.1.2 對S180荷瘤小鼠脾臟、胸腺指數(shù)的影響結(jié)果見表2表2 對S180荷瘤小鼠免疫器官的影響

3.2 對H22荷瘤小鼠的影響

3.2.1 對H22荷瘤小鼠抑瘤率的影響結(jié)果見表3表3 對H22荷瘤小鼠抑瘤作用的影響

3.2.2 對H22荷瘤小鼠脾臟、胸腺指數(shù)的影響結(jié)果見表4表4 對H22荷瘤小鼠免疫器官的影響

4 討論

壁虎在臨床上常用于腫瘤，特別是消化道腫瘤的治療，一般焙干研細(xì)或水煎煮入藥，但壁虎起抗腫瘤作用的物質(zhì)基礎(chǔ)還不清楚。小分子肽抗腫瘤作用逐漸引起了人們的注意。越來越多的研究表明，動(dòng)、植物含有小分子肽具有很好的抗腫瘤作用，世界上許多國家正在競相研究開發(fā)小分子肽類抗腫瘤的防治藥物，如谷胱甘肽、海參五肽、槲寄生肽、胸腺五肽等[8，9]。本研究運(yùn)用酶解的方式，使壁虎含有的蛋白類成分酶解成小分子肽，對其抗腫瘤作用進(jìn)行研究。研究結(jié)果表明，壁虎經(jīng)酶解后的抗腫瘤作用明顯高于原粉組與水煎煮組。

本實(shí)驗(yàn)中的壁虎仿生酶解是指模擬人體消化過程，先用胃蛋白酶酶解，再以胰蛋白酶酶解的方法，對壁虎藥材進(jìn)行酶解。

小分子肽的界限劃分迄今未有明確定義，鑒于國內(nèi)外熱門研究小分子肽的相對分子質(zhì)量都在3 000以下[10]，本實(shí)驗(yàn)中3種酶解液均為經(jīng)過超濾所得的相對分子質(zhì)量小于3 000的小分子肽。

參考文獻(xiàn)

[1] 葉云珍. 中藥壁虎的研究進(jìn)展[J].中藥材，2009，32(7):1160.

[2] Shimonishi Y. Peptide Science-Present and Future[M].Dordrecht:Kluwer Academic Publishers，1999:436.

[3] 王愛華，柳美玲，戴志明，等.小肽的吸收機(jī)制與營養(yǎng)價(jià)值研究進(jìn)展[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2008，2:7.

[4] 王克夷.開發(fā)小肽，篩選新藥[J].中國生化藥物雜志，2003，24(1):48.

[5] 錢 方，鄧 巖，劉 陽，等.胃蛋白酶水解大豆蛋白的研究[J].中國乳品工業(yè)，2001，29(3):10.

[6] 黃開華，周艷明，吳 畏，等.胰蛋白酶酶解鹿血條件的優(yōu)化[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，46(2):302.

[7] 徐叔云.藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2001:1270.

[8] 徐桂華，畢力夫，蘇秀蘭.抗腫瘤生物活性肽研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥生物技術(shù)，2007，2(2):130.

篇10

【關(guān)鍵詞】 胃腫瘤;乙酰肝素酶;基質(zhì)金屬蛋白酶9;免疫組織化學(xué)

[ABSTRACT] Objective:To investigate the clinicopathological significance of the expression of heparanase (Hpa) and MMP9， and its relationship to progressing in gastric carcinoma. Methods： The expression of Hpa and MMP9 were detected by immunohistochemistry SABC in 65 gastric carcinoma cases and 20 adjacent nonneoplastic tissues. The positive ratios of Hpa and MMP9 were compared in gastric carcinoma tissues and adjacent nonneoplastic tissues as well as perse deep infiltration tissues with or without lymph node metastasis. The correlation analysis of Hpa and MMP9 expression in gastric carcinoma tissue was assessed. Results：The positive ratios of Hpa and MMP9 were significant higher in gastric carcinoma tissue than that in adjacent nonneoplastic tissue(P

[KEY WORDS] Gastric carcinoma; Heparanase; Matrix metalloproteinase 9; Immunohistochemistry

腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過程。乙酰肝素酶(Hpa)是目前已確定的唯一能夠降解硫酸乙酰肝素蛋白多糖基因(HSPG)的蛋白酶， 通過特異性降解HSPG發(fā)揮其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用;基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases9，MMP9)是一種鋅離子依賴性內(nèi)肽酶，主要降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜中的膠原蛋白，在破壞細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的屏障作用、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中同樣具有作用。Hpa mRNA的檢測在多種腫瘤中已有研究報(bào)道，但目前聯(lián)合檢測Hpa和MMP9在胃癌中的表達(dá)少有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)對65例胃癌切除標(biāo)本Hpa和MMP9的表達(dá)進(jìn)行了檢測，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取河源市人民醫(yī)院2003～2005年胃癌手術(shù)切除標(biāo)本65例，男性47例，女性18例，年齡35～78歲，中位年齡60歲，其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者40例。所有病例術(shù)后均經(jīng)病理證實(shí)。另取癌旁非瘤組織20例作為對照，癌旁組織距離腫瘤邊緣不小于5 cm。

1.2 Hpa、MMP9的檢測

采用免疫組化SABC法進(jìn)行檢測。Hpa抗體、即用型SABC免疫組化染色試劑盒及DAB顯色試劑盒購于武漢博士得生物工程有限公司;兔抗人MMP9多克隆抗體為北京中山生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，均在4℃冰箱保存。用已知的陽性切片作陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 Hpa Hpa以細(xì)胞膜和/或細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，以染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例評定陽性表達(dá)。參照Friedmann等[1]的方法，每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)視野，每個(gè)視野觀察100個(gè)腫瘤細(xì)胞，計(jì)數(shù)500個(gè)腫瘤細(xì)胞中陽性染色的細(xì)胞數(shù)，陽性細(xì)胞記數(shù)僅限于腫瘤細(xì)胞染色。染色強(qiáng)度分級(jí)如下：無著色為0，淡黃色為1，黃色及更深顏色為2;陽性細(xì)胞數(shù)分級(jí)為:陽性細(xì)胞數(shù)小于50%為0， 50%～75%為1，>75%為2。染色強(qiáng)度分級(jí)與陽性細(xì)胞數(shù)分級(jí)兩項(xiàng)得分相乘結(jié)果≥2為陽性表達(dá)。

1.3.2 MMP9 MMP9以細(xì)胞漿和/或細(xì)胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，參照Liaball等[2]的方法，每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)視野，每個(gè)視野觀察100個(gè)腫瘤細(xì)胞，計(jì)數(shù)500個(gè)腫瘤細(xì)胞中陽性染色的細(xì)胞數(shù)，陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)僅限于腫瘤細(xì)胞染色，10%及以上細(xì)胞陽性染色的切片為陽性，10%以下陽性染色的切片為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件，行χ2檢驗(yàn)或精確概率法及Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Hpa的表達(dá)

Hpa蛋白陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞漿和/或細(xì)胞膜，腫瘤間質(zhì)中的血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞也偶有陽性表達(dá)，胃癌中Hpa的陽性表達(dá)率為60%(39/65);在癌旁非瘤組織中，血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞偶有陽性表達(dá)， Hpa的陽性表達(dá)率為15%(3/20)，胃癌中的表達(dá)明顯高于癌旁非瘤組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.390，P

2.2 MMP9的表達(dá)

MMP9在正常胃黏膜細(xì)胞中著色均勻，主要分布于細(xì)胞胞漿內(nèi)，陽性表達(dá)率為15%(3/20);在胃癌組織中的表達(dá)異質(zhì)明顯，呈灶狀或彌散性分布，陽性表達(dá)率為55.4%(36/65)，胃癌中的表達(dá)明顯高于癌旁非瘤組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.046，P

2.3 不同腫瘤浸潤深度及淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移胃癌患者Hpa、MMP9的表達(dá)

腫瘤浸潤深度達(dá)到或超過漿膜層的胃癌患者Hpa、MMP9的陽性表達(dá)率明顯高于未達(dá)漿膜層者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

2.4 Hpa、MMP9在胃癌中陽性表達(dá)的相關(guān)性

經(jīng)相關(guān)性檢驗(yàn)，Hpa、MMP9在胃癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.531，P=0.000)，見表2。表2 Hpa、MMP9在胃癌中表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

腫瘤細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)(extracellar matrix，ECM)成分及其基底膜的降解是腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是人體內(nèi)降解ECM的主要酶類，參與腫瘤演進(jìn)等眾多生理和病理過程[3，4]，MMP9作為MMPs家庭重要成員，具有廣泛的酶底物特性，是降解基底膜成分IV型膠原的主要酶[5]。Sier等[6]的研究結(jié)果顯示胃癌組織MMP9表達(dá)顯著高于臨近的正常胃粘膜，MMP9高表達(dá)的胃癌患者生存期明顯縮短;David等[7]研究表明，與正常胃粘膜相比，胃癌組織MMPs表達(dá)明顯升高，MMPs表達(dá)與胃癌分期密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者M(jìn)MP9陽性表達(dá)率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，說明MMP9在胃癌細(xì)胞突破基底膜向周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用; MMP9的表達(dá)還與胃癌的浸潤深度密切相關(guān)(P

Hpa是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜中主要成分HSPG的蛋白水解酶，其在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中具有重要的意義。 Vlodavsky等[9]研究發(fā)現(xiàn)高轉(zhuǎn)移潛力的腫瘤細(xì)胞Hpa活性比低或無轉(zhuǎn)移潛力的腫瘤細(xì)胞高4～10倍。在卵巢腺癌、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞、口腔鱗狀細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌以及前列腺癌、膀胱癌和胰腺癌中Hpa mRNA和蛋白呈優(yōu)勢表達(dá)。Hulett等[10]也發(fā)現(xiàn)高轉(zhuǎn)移的鼠腺癌細(xì)胞系表達(dá)高水平Hpa mRNA，而低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系僅有少量表達(dá)。Takaoka等[11]用RTPCR檢測胃癌組織中Hpa的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，正常胃粘膜組織中無Hpa的表達(dá)，胃癌組織中Hpa的表達(dá)與腫瘤體積和局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明顯正相關(guān)性，高表達(dá)Hpa的患者預(yù)后差。本研究結(jié)果顯示，Hpa的陽性表達(dá)與胃癌的浸潤深度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，表明在胃癌的進(jìn)展過程中，Hpa具有重要的作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，Hpa和MMP9在胃癌細(xì)胞上的表達(dá)呈正相關(guān)，推測Hpa和MMP9在胃癌浸潤轉(zhuǎn)移過程中存在相互關(guān)聯(lián)、相互作用，聯(lián)合檢測Hpa和MMP9在判斷腫瘤生物學(xué)行為及預(yù)后方面具有重要意義。

參考文獻(xiàn)

1 Friedmann Y， Vlodavsky I，Aingon H，et al. Expression of heparanase in normal， dysplastic， and neoplastic human colonic mucosa and stroma evidence for its role in colonic tumorigensis[J]. Am J Pathol， 2000，157(4):11671175.

2 Liaball NB， Talbot I， Smith RA， et al. Matrix metalloprtease 2 (MMP2) and matrix metalloprtease 9 (MMP9)， type IV collagenase in colorectal cancer[J]. Cancer Res， 1996，56(3):190196.

3 Chambers AF， Matrisian LM. Changing views of the role of matrix metalloprotinases inmetastasis [J].J Natl Cancer Inst， 1997，89(17):12601270.

4 陳莉萍，劉嘉茵.血清基質(zhì)金屬蛋白酶-9和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1在接受IVF-ET患者中的測定[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，2008，12(9)：110111.

5 Liotta LA， Steeg PA， StetlerStevenson WG. Cancer metastasis and angiogenesis:an imbalance of positive and negative regulation[J].Cell，1991，64(2):327336

6 Sier CFM， Kubben FJ， Canesh S， et al. Tissue levels of matrix metalloproteinase MMP2 and MMP9 and related to the overall survival of patients with gastric carcinoma[J]. Br J Cancer， 1996，74:413 417.

7 David L， Nesland J， Holm R， et al. Expression of lamin， collafen Ⅳ， fibronectin and type Ⅳcollafenase in fastric carcinoma[J]. Cancer，1994，13:518527.

8 張成武，鄒壽椿，徐文娟，等.胃癌基質(zhì)金屬蛋白酶臨床意義 [J].中國胃腸外科雜志，2000，3(1):2527.

9 Vlodavsky I， Fridmann Y， Elkin M， et al. Mammalian heparanase: gene cloning， expression and function in tumor progression and metastasis[J]. Nat Med， 1999，5(7):793802.