導(dǎo)語(yǔ)：人體充質(zhì)干細(xì)胞分離的生物學(xué)分析論文一文來(lái)源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【摘要】目的比較人羊水源性及臍血源性的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)分離、培養(yǎng)及其生物學(xué)特性，為組織工程選取種子細(xì)胞提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法用貼壁分離培養(yǎng)的方法分離兩種來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞，觀察其形態(tài)與生長(zhǎng)曲線，并用細(xì)胞化學(xué)染色的方法測(cè)定其生物化學(xué)特性。結(jié)果兩種來(lái)源的標(biāo)本均可成功分離出MSCs，但是孕中期羊水源性MSCs增殖能力要明顯強(qiáng)于新生兒臍血源性的MSCs，二者有相似的生物化學(xué)特性。結(jié)論孕中期羊水與新生兒臍血來(lái)源的MSCs是很好的組織工程種子細(xì)胞,新生兒臍血來(lái)源的MSCs的增殖能力相對(duì)較弱，應(yīng)用受到一定的限制。

【關(guān)鍵詞】孕中期羊水;間充質(zhì)干細(xì)胞;臍血

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSCs)具有多向分化潛能,是細(xì)胞治療及基因治療的理想種子細(xì)胞。已有研究顯示羊水[1]和臍血[2]可以分離出MSCs，那么這兩種來(lái)源的MSCs有哪些異同呢?為此本研究將對(duì)孕中期人的羊水及新生兒的臍血進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)，并對(duì)其基本生物學(xué)特性進(jìn)行了比較研究，為組織工程選取種子細(xì)胞提供基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下論文。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源

羊水標(biāo)本取自2008年3月至2010年3月吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬465醫(yī)院婦產(chǎn)科，妊娠在15～22周的引產(chǎn)羊水35份;32份臍帶血標(biāo)本取自正常足月剖腹產(chǎn)或足月正常產(chǎn)乙肝病毒檢測(cè)陰性的孕婦。取標(biāo)本前均征得孕婦本人同意，研究獲得吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬465醫(yī)院道德倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要試劑與儀器

PRMI1640(GIBCOBRL)，胎牛血清(GIBCOBRL)，馬血清(GIBCOBRL)，1.077×103g/LFicoll淋巴細(xì)胞分離液(上海試劑二廠)，細(xì)胞化學(xué)染色試劑盒(BASO公司)，CO2培養(yǎng)箱(FormaScientific公司)，熒光倒置顯微鏡(TE300,Nikon公司)。

1.3孕中期羊水MSCs的分離與培養(yǎng)羊水標(biāo)本在室溫下1500r/min離心5min，棄上清，加入含10%胎牛血清(FBS)的PRMI1640培養(yǎng)液，制成密度為(1～5)×105個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，接種到φ60mm塑料培養(yǎng)皿中，置飽和濕度、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第3天首次換液，去除非貼壁細(xì)胞，當(dāng)類成纖維樣細(xì)胞鋪滿平皿達(dá)80%時(shí)，用0.25%的胰酶消化，用PRMI1640培養(yǎng)液制成濃度為4×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種到新培養(yǎng)皿中，記為第1代(P1)。每3d用含10%FBS的PRMI1640培養(yǎng)液換液1次，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到90%融合時(shí)按1∶4的比例傳代。

1.4新生兒臍帶血MSCs的分離與培養(yǎng)無(wú)菌條件下取正常足月剖腹產(chǎn)或足月正常產(chǎn)乙肝病毒檢測(cè)陰性孕婦的臍帶血50～80mL，放于含CPDA1復(fù)合抗凝劑的采血袋中，所有樣本均在采集后12h內(nèi)進(jìn)行分離;將臍血用等量的DHank′s液稀釋制成細(xì)胞懸液,細(xì)胞懸液沿管壁緩慢加入到相對(duì)密度為1.077×103g/LFicoll人淋巴細(xì)胞分離液上層,其比例為2∶1,注意液面清晰分層，以1500r/min進(jìn)行梯度離心20min，然后緩慢吸取中間交界面細(xì)胞懸液至另一離心管，獲得含人MSCs的單個(gè)核細(xì)胞懸液，加入含10%FBS的PRMI1640完全培養(yǎng)基,吹打并計(jì)數(shù)。以5×105個(gè)/mL的密度接種到φ60mm培養(yǎng)皿中，48h首次換液,以后每3d換液。換液用含10%FBS的PRMI1640完全培養(yǎng)基。在細(xì)胞80%左右融合時(shí),用0.25%胰酶室溫消化5min，適量小牛血清終止消化反應(yīng)，吸管輕輕吹打，轉(zhuǎn)入離心管中1500r/min離心10min，棄上清，按1∶3比例傳代。

1.5MSCs的生長(zhǎng)曲線測(cè)定將傳至3、5、8代的MSCs制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/mL，接種于24孔培養(yǎng)板，每孔0.5mL;每天取3孔，消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，共8d。以時(shí)間(d)為橫坐標(biāo),細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.6MSCs的代謝情況檢測(cè)傳3代的羊水MSCs按5×104/mL密度接種于φ35mm的培養(yǎng)皿中。2d后分別對(duì)培養(yǎng)皿中的細(xì)胞進(jìn)行POX、SB、PAS、αNAE和ALP細(xì)胞化學(xué)染色，顯微鏡觀察、拍照。同樣，新生兒臍血源性MSCs取第3代以后細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)染色分析。

2結(jié)果

2.1羊水MSCs

從羊水中分離出的細(xì)胞,將之接種于PRMI1640培養(yǎng)基中,2～3d部分細(xì)胞開(kāi)始貼壁,4～7d逐漸出現(xiàn)貼壁的MSCs,開(kāi)始為圓形,逐漸伸出突起,呈成纖維樣、梭形，最初散在分布,后逐漸在局部形成集落生長(zhǎng)(圖1)。一周以后MSCs迅速擴(kuò)增(圖2),約10d后可達(dá)80%～90%融合,擴(kuò)增變緩,即可傳代。傳代后羊水MSCs5～6h即可貼壁,2～4d生長(zhǎng)迅速,1周后即可再次傳代。形態(tài)為均一的成纖維樣的MSCs，呈漩渦樣生長(zhǎng),即為羊水源性的MSCs(圖3)。

2.2新生兒臍血MSCs

臍血的單個(gè)核細(xì)胞懸液接種于φ60mm的塑料培養(yǎng)皿中，原代培養(yǎng)6d后，在倒置顯微鏡下可見(jiàn)單個(gè)或少量呈集落生長(zhǎng)的貼壁細(xì)胞，形態(tài)大多為橢圓形或短梭形，凸出于培養(yǎng)皿表面。粘附于貼壁細(xì)胞之上的造血細(xì)胞和其他細(xì)胞在換液的過(guò)程中逐漸被清除，10d后就形成細(xì)小纖維狀小集落，20～25d后細(xì)胞集落不斷地?cái)U(kuò)大并形成融合超過(guò)80%，細(xì)胞形態(tài)大多呈短梭形。傳代培養(yǎng)后的臍血MSCs12h即可貼壁，4～14d生長(zhǎng)迅速,10d后即可再次傳代,細(xì)胞呈短梭形生長(zhǎng)(圖4，25×)。10代左右細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)開(kāi)始急劇衰退,細(xì)胞顆粒化嚴(yán)重，增殖速度嚴(yán)重放慢。

2.3MSCs的生長(zhǎng)曲線

人羊水源性MSCs生長(zhǎng)曲線呈“S”形，傳代后第1、2天為潛伏適應(yīng)期，從第3天開(kāi)始細(xì)胞增殖加速并進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第6至7天達(dá)到高峰，以后進(jìn)入平臺(tái)期。通過(guò)對(duì)第3、5、8代新生兒臍血源性的MSCs細(xì)胞計(jì)數(shù),繪制的生長(zhǎng)曲線形狀與羊水源性MSCs生長(zhǎng)曲線形狀相似，呈S形(圖5);傳代第1至3天為生長(zhǎng)停滯期，第4對(duì)14天為快速增殖期，后即進(jìn)入平臺(tái)期。隨傳代次數(shù)增加,MSCs的增殖能力有所減弱。第3、5代細(xì)胞增殖能力最強(qiáng),第8代細(xì)胞較第3、5代細(xì)胞增殖能力減弱較明顯，但亦呈“S”形。

2.4不同源性MSCs的生物化學(xué)特征

羊水源性MSCs及臍血源性MSCs具有相同的生物化學(xué)特征，染色結(jié)果都顯示：POX、SB染色為陰性，αNAE、PAS為強(qiáng)陽(yáng)性，ALP染色有1%為弱陽(yáng)性，這與文獻(xiàn)報(bào)道的MSCs的染色特點(diǎn)相一致[34]。進(jìn)一步證明了培養(yǎng)出的成纖維樣細(xì)胞為MSCs。圖1.4d羊水貼壁細(xì)胞圖2.7d羊水貼壁細(xì)胞圖3.10d羊水貼壁細(xì)胞圖4.10d臍血貼壁細(xì)胞圖5.羊水臍血MSCs生長(zhǎng)曲線

3討論

間質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能，是細(xì)胞組織工程的首選種子細(xì)胞之一。然而人骨髓中的MSCs含量較少，大約104～105個(gè)骨髓單個(gè)核細(xì)胞中只含有一個(gè)MSCs[5],這顯然難以滿足細(xì)胞組織工程的實(shí)際需要，因此尋找MSCs的來(lái)源和如何在體外分離擴(kuò)增MSCs就顯得較為重要。為了更好的得到MSCs，我們分別對(duì)孕婦的羊水和新生兒臍帶血進(jìn)行了MSCs的分離，并對(duì)所得的MSCs生物學(xué)特性進(jìn)行了比較，以期得到更好的MSCs來(lái)源。

間充質(zhì)干細(xì)胞的分離,我們主要參考了Friedenstein建立的MSC分離方法并做了適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)，利用MSCs的粘附性來(lái)獲得MSCs。本實(shí)驗(yàn)將羊水細(xì)胞和臍血單個(gè)核細(xì)胞接種于含10%胎牛血清PRMI1640培養(yǎng)基中，3d后去除未貼壁細(xì)胞，待細(xì)胞單層長(zhǎng)滿80%后，用胰酶消化傳代，本法可去除一些貼壁的非間質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)過(guò)幾次傳代后即可得到相對(duì)較純的MSCs。

本研究中采用孕婦的羊水和新生兒臍帶血標(biāo)本都可以成功地得到MSCs，這與國(guó)外報(bào)道的相一致[6]，可作為未來(lái)組織工程學(xué)的一個(gè)不可或缺的來(lái)源[7]。兩者在形態(tài)和生物學(xué)特性上都非常類似，但是臍血源性的MSCs形態(tài)呈短梭形。明顯不同的就是人羊水源性MSCs增殖能力明顯要優(yōu)于臍血源性MSCs,這一點(diǎn)可以從生長(zhǎng)曲線與傳代能力都得到較好體現(xiàn)。人羊水源性MSCs群體倍增時(shí)間較臍血源性MSCs倍增時(shí)間短，且人羊水源性MSCs的傳代能力明顯強(qiáng)于臍血源性MSCs。

綜上所述，與臍血源性間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力相比,羊水MSCs的獲得更為可觀，是組織工程種子細(xì)胞的又一可靠來(lái)源。

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