導(dǎo)語(yǔ)：紅細(xì)胞Rh抗原研究論文一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【摘要】本研究旨在探究mPEG修飾的紅細(xì)胞rh抗原的穩(wěn)定性。利用紅細(xì)胞膜蛋白SDS-PAGE電泳技術(shù)分析mPEG修飾后紅細(xì)胞膜蛋白與mPEG結(jié)合情況，用紅細(xì)胞血影凝集實(shí)驗(yàn)及4℃CPD保養(yǎng)液保存的修飾紅細(xì)胞與匹配血液體外混血實(shí)驗(yàn)，觀察mPEG修飾后紅細(xì)胞Rh抗原被遮蔽的穩(wěn)定性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不同保存時(shí)間的mPEG修飾的紅細(xì)胞在模擬輸血（即混血前后）的血型保持不變，同時(shí)mPEG修飾的紅細(xì)胞在保存過程中游離血紅蛋白水平正常，并且混血后經(jīng)37℃孵育的mPEG修飾的紅細(xì)胞游離血紅蛋白水平低于不混合的修飾的紅細(xì)胞。比較分析PEG特異的碘染和考馬斯亮藍(lán)染的顯色圖譜發(fā)現(xiàn)，特殊的碘染顯示出mPEG與紅細(xì)胞膜蛋白結(jié)合的條帶，mPEG-SPA與紅細(xì)胞膜蛋白結(jié)合后導(dǎo)致蛋白分子遷移速度發(fā)生改變。mPEG修飾的紅細(xì)胞血影凝集實(shí)驗(yàn)證實(shí)，修飾紅細(xì)胞在質(zhì)膜裂損后mPEG仍有效地遮蔽抗原。結(jié)論：mPEG-SPA不論在紅細(xì)胞膜蛋白被單獨(dú)提取后，還是膜破損后以及存活狀態(tài)下，均能與紅細(xì)胞膜蛋白穩(wěn)固結(jié)合。

【關(guān)鍵詞】mPEG修飾紅細(xì)胞；Rh抗原；紅細(xì)胞

RhAntigenStabilityofmPEGModifiedRedBloodCells

AbstractTheobjectiveofstudywastoinvestigatetheRhantigenstabilityofmPEG-modifiedRBC.RBCmembraneproteinSDS-PAGEtechnologywasusedtoanalyzethecombinationofthemPEGmodifiedRBCmembraneproteinwithmPEGmolecules;theRBCghostcoagulationtestand4℃CPD-preservedmodifiedRBCmixedwithmatchedbloodwereusedtoobservethestabilityofRBCRhantigencamouflagedbymPEG.TheresultsshowedthatthebloodgroupsofstoredmPEG-modifiedRBCwerekeptconsistencybeforeoraftersimulatingtransfusion,i.e.mixtureofmodifiedRBCwithmatchedbloods,whiletheplasmahemoglobinaftersimulatingtransfusionwasnotonlywithinthenormalrangeduringthestorage,butalsolessthanthatbeforesimulatingtransfusionevenafterincubationat37℃.TheelectrophoresispatternstainedwithiodineandCoomassiebluedisplayedthebandsofmPEGcombinedwithRBCmemberaneproteinandtheslowmobilityofmembraneprotein.ThehemagglutinationofPEGylationRBCghostsdidnottakeplaceandmPEGstillcoveredtheantigen.Inconclusion,mPEG-SPAcanbindtheerythrocytewithitsextractedmembraneproteininbothghostsandlivingerythrocytes.

KeywordsmPEGmodifiedredbloodcell;Rhantigen;redbloodcell

mPEG-SPA可以與蛋白質(zhì)和多肽中的賴氨酸（K）、精氨酸(R)的胺基、組氨酸(H)的咪唑基以及酪氨酸(Y)的羥基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成共價(jià)結(jié)合鍵，從而結(jié)合到蛋白質(zhì)多肽上［1］，達(dá)到遮蔽抗原的作用。mPEG與紅細(xì)胞膜Rh抗原結(jié)合后是否穩(wěn)定，進(jìn)入人體后是否會(huì)脫落，這些問題關(guān)系到修飾后紅細(xì)胞進(jìn)入人體后的安全性。為此，我們采用mPEG修飾的紅細(xì)胞膜蛋白SDS-PAGE電泳、紅細(xì)胞血影凝集實(shí)驗(yàn)以及用4℃CPD保養(yǎng)液保存的修飾紅細(xì)胞與匹配血液進(jìn)行的體外混血實(shí)驗(yàn)，對(duì)mPEG修飾后紅細(xì)胞Rh抗原被遮蔽的穩(wěn)定性進(jìn)行了初步的研究。

材料和方法

樣品

20mmol/LmPEG-SPA修飾的AB、RhDEeCc紅細(xì)胞，AB、RhD-全血，RhD血液血漿。

試劑

CPD保養(yǎng)液、低滲磷酸緩沖液（20mOSM，pH7.4）、10mmol/LTris-鹽酸低滲緩沖液、等滲液、電泳緩沖液、30%聚丙烯酰胺凝膠溶液、分離膠緩沖液、濃縮膠緩沖液、10%分離膠、10%基層膠、0.25%考馬斯亮藍(lán)R-250、脫色液、樣品處理液、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)物（marker）。

儀器

倒置顯微鏡、KUBOTA2100離心機(jī)（Japan）、EBA12RZentrifugen低溫高速離心機(jī)（Beckman公司產(chǎn)品，Germany）、XMTB數(shù)顯調(diào)節(jié)儀水浴鍋（浙江余姚工業(yè)儀表二廠產(chǎn)品）、Mini-ProteanⅡ型電泳儀（Bio-Rad公司產(chǎn)品，USA）、TS-1型脫色搖床（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品）。

mPEG修飾紅細(xì)胞體外穩(wěn)定性檢測(cè)

將CPD保存的血比容為35%的20mmol/LmPEG-SPA修飾的ABRhDEeCc紅細(xì)胞、ABRhD-全血、RhD血漿分裝，于2-6℃保存并在儲(chǔ)存第1、7、14、21天時(shí)取CPD保存的修飾的ABRhDEeCc紅細(xì)胞50μl，用間接抗人球蛋白試驗(yàn)鑒定血型后，分別加入250μl的ABRhD-全血和RhD血漿，以CPD保存的血比容為35%的20mmol/LmPEG-SPA修飾的ABRhDEeCc紅細(xì)胞RhD-全血和RhD血漿作為對(duì)照，在37℃搖動(dòng)孵育24小時(shí)后，再次檢測(cè)血型和血漿游離血紅蛋白。

mPEG修飾的紅細(xì)胞血影凝集實(shí)驗(yàn)

取未修飾和修飾的紅細(xì)胞各40μl，加10倍體積的PBS（pH7.4），4℃放置30分鐘，3500×g/min離心10分鐘，棄上清，加入600μl的低滲磷酸緩沖液，4℃放置30分鐘，3500×g/min離心10分鐘，棄上清，低滲磷酸緩沖液洗滌4次，3500×g/min離心10分鐘，沉淀即為血影細(xì)胞。在血影細(xì)胞加入Rhanti-D多抗后，在倒置顯微鏡下觀察結(jié)果。

mPEG修飾的紅細(xì)胞膜蛋白的SDS-PAGE分析

紅細(xì)胞膜蛋白的提取取CPD抗凝血100μl，以2000×g/min10℃離心5分鐘，除去血漿和灰白色血細(xì)胞層；另取mPEG-SPA修飾紅細(xì)胞約40μl，加預(yù)冷的等滲液將沉淀RBC懸浮，以2000×g/min10℃離心5分鐘，除去上清液，如此重復(fù)洗滌3遍；按1∶10（v/v）向沉淀RBC中加入預(yù)冷的低滲液，混勻后4℃放置至紅細(xì)胞完全溶血；以1000×g/min，4℃離心10分鐘，除去上清液，將沉淀在4℃用低滲液6000×g/min離心5分鐘，洗滌3次，獲得白色的RBC膜樣品。

電泳分別配制10%分離膠和基層膠，灌分離膠，37℃放置40分鐘，待膠凝固，灌基層膠，放梳子組裝電泳裝置；將蛋白marker及取得的RBC膜樣品各10μl與5×樣品緩沖液在Eppendorf管中混合；95℃加熱5分鐘，將蛋白變性；用微量加樣槍將樣品加入樣品孔底部；180V恒壓電泳至溴酚藍(lán)指示劑移動(dòng)至電泳膠外。

PEG碘染色［2］將電泳后的膠放入容器內(nèi)，在搖床上緩慢振蕩的過程中加入20ml0.1mol/L的高氯酸，15分鐘后依次加入5ml5%氯化鋇，2ml0.1mol/L碘溶液。5分鐘后見到碘染的PEG條帶逐漸出現(xiàn)，拍照、記錄結(jié)果。

考馬斯亮藍(lán)染色將碘染的膠放在蒸餾水中漂洗約20分鐘，碘染條帶逐漸消失；將約20ml考馬斯亮藍(lán)染液放入盛膠的容器里，搖床緩慢振蕩約2小時(shí)，將染液棄去，再在水中漂洗數(shù)次，然后加入脫色液，脫色的條帶清晰，背景變淺，其中更換脫色液數(shù)次，拍照、記錄結(jié)果。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS10.0軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行Chi-square檢驗(yàn)。

結(jié)果

mPEG修飾紅細(xì)胞體外穩(wěn)定性

修飾的ABRhDEeCc紅細(xì)胞在儲(chǔ)存過程中和模擬輸血過程（即與全血和血漿混合后于37℃孵育24小時(shí)）,Rh血型D、E、e、Ch和c抗原未發(fā)生變化，mPEG修飾紅細(xì)胞在保存過程中血漿游離血紅蛋白水平正常，修飾的ABRhDEeCc紅細(xì)胞在模擬輸血過程后，游離血紅蛋白未見升高，反而降低，且1組和6組在統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異，1組和7組在統(tǒng)計(jì)學(xué)同樣有顯著差異（附表）。Table.Plasmafreehemoglobinchangeintheprocessofbloodmixture（略）

mPEG修飾的紅細(xì)胞血影凝集

mPEG-SPA修飾前后的紅細(xì)胞處理得到的血影和IgGMRhD多克隆抗體，用直接凝集實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明mPEG修飾前的紅細(xì)胞發(fā)生了凝集，而mPEG-SPA修飾后的紅細(xì)胞未發(fā)生凝集（圖1）。

mPEG修飾的紅細(xì)胞膜蛋白的SDS-PAGE電泳分析

紅細(xì)胞膜蛋白經(jīng)SDS-PAGE碘和鋇染色后，未修飾紅細(xì)胞膜蛋白和蛋白marker均未出現(xiàn)，只有2.0mmol/LmPEG-SPA修飾的紅細(xì)胞膜蛋白出現(xiàn)條帶，主要是血影蛋白、條帶3，條帶4.1和4.2及血型糖蛋白（圖2）；紅細(xì)胞膜蛋白經(jīng)SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色后，蛋白marker、2.0mmol/LmPEG-SPA修飾的、未修飾的紅細(xì)胞膜蛋白均出現(xiàn)條帶；未修飾的紅細(xì)胞膜條帶3、條帶4.1、條帶4.2、肌動(dòng)蛋白和血型糖蛋白條帶的遷移速度均快于修飾的紅細(xì)胞膜蛋白條帶（圖3）。

討論

mPEG與紅細(xì)胞膜只有穩(wěn)定結(jié)合，才能保證其輸入人體后不脫落，被修飾的抗原不會(huì)暴露，因而不會(huì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。在對(duì)重組蛋白、酶、藥物等的應(yīng)用和研究基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)，PEG與蛋白分子共價(jià)結(jié)合后會(huì)進(jìn)一步吸附水分子，使蛋白分子具有一個(gè)PEG和水分子包裹親水外殼，這個(gè)外殼能有效地遮蔽蛋白質(zhì)表面的抗原［3］。已有研究結(jié)果顯示，Rh血型抗原膜外的1、2、3、4、5環(huán)上均存在與mPEG-SPA發(fā)生反應(yīng)的氨基酸K、R、H和Y，后者是mPEG共價(jià)結(jié)合蛋白質(zhì)氨基酸物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，從理論上講結(jié)合應(yīng)是穩(wěn)定的。由于目前缺乏成熟的修飾紅細(xì)胞動(dòng)物評(píng)價(jià)模型［4］，因此我們?cè)O(shè)計(jì)了mPEG修飾紅細(xì)胞體外穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：不同保存時(shí)間的mPEG修飾的紅細(xì)胞在模擬輸血即混血前后的血型保持不變，這一結(jié)果不僅支持修飾的紅細(xì)胞血型在體外不變，而且也提示其進(jìn)入體內(nèi)應(yīng)是穩(wěn)定的；同時(shí)mPEG修飾的紅細(xì)胞在保存過程中游離血紅蛋白水平正常，并且混血后經(jīng)37℃孵育的mPEG修飾的紅細(xì)胞游離血紅蛋白水平低于不混合的修飾紅細(xì)胞，這不僅說明mPEG與紅細(xì)胞的結(jié)合是穩(wěn)固的，同時(shí)表明全血和血漿與保存期間的mPEG修飾紅細(xì)胞混合，不僅不會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能損傷，而且有利于mPEG修飾紅細(xì)胞功能維持和恢復(fù)，mPEG仍穩(wěn)固與紅細(xì)胞結(jié)合起著遮蔽抗原的作用。已知，SDS-PAGE電泳分析可以顯示紅細(xì)胞膜上分子量從15000-250000的15種主要蛋白，包括血影蛋白（spectrin，MW：240000；220000）、錨蛋白（ankyrin）、條帶3(MW：100000)、條帶4.1、條帶4.2、肌動(dòng)蛋白（actin）和血型糖蛋白(glycophorin，MW:30000）［5］。

Scott等［6］研究結(jié)果表明，與mPEG結(jié)合的膜蛋白會(huì)由于分子量的改變使電泳的帶型發(fā)生變化，并且表現(xiàn)出劑量依賴性；而且已有的結(jié)果也表明，mPEG可以與紅細(xì)胞膜蛋白血影蛋白、條帶3、條帶4.1、條帶4.2、肌動(dòng)蛋白和血型糖蛋白結(jié)合［7］。本研究中對(duì)保存期21天mPEG-SPA修飾的紅細(xì)胞膜蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，先用碘染色，脫色后再用考馬斯亮藍(lán)染色，比較分析PEG特異的碘染和考馬斯亮藍(lán)染色顯色圖譜，發(fā)現(xiàn)特殊的碘染色可以顯示出mPEG與紅細(xì)胞膜蛋白結(jié)合的條帶，mPEG-SPA與紅細(xì)胞膜蛋白結(jié)合后導(dǎo)致蛋白分子遷移速度發(fā)生改變。這一結(jié)果證實(shí)了mPEG-SPA即使在紅細(xì)胞膜蛋白被單獨(dú)提取后仍與與紅細(xì)胞膜蛋白穩(wěn)固結(jié)合的。依據(jù)血影仍保持有抗原性，且可與相應(yīng)抗體結(jié)合產(chǎn)生凝集現(xiàn)象的原理，我們的mPEG修飾的紅細(xì)胞血影凝集實(shí)驗(yàn)不僅證實(shí)了修飾紅細(xì)胞在質(zhì)膜裂損后血影抗原仍能與mPEG結(jié)合，而且mPEG仍可有效地遮蔽抗原，使抗原不與相應(yīng)抗體結(jié)合而不發(fā)生凝集現(xiàn)象，這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)mPEG-SPA與紅細(xì)胞膜穩(wěn)固結(jié)合。

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