導(dǎo)語(yǔ)：醫(yī)學(xué)生社會(huì)實(shí)踐論文：小鼠Wnt一文來(lái)源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【關(guān)鍵詞】Wnt

ExpressionandbiologicalactivityofmouseWnt3ageneinNIH3T3cells

【Abstract】AIM:ToexpressrecombinantmouseWnt3asignalproteinwithbiologicalactivity.METHODS:Therecombinanteukaryoticexpressionplasmid,pSecTag2/HygroBWnt3a,wastransfectedintoNIH3T3cellsbyliposome,thentheexpressedproteinwasdetectedbyWesternBlot.ThesaturationdensityandthecapabilityofsuppressingapoptosisinWnt3a/NIH3T3cellswereevaluated.RESULTS:TheWnt3asignalproteinwasstablyexpressedinWnt3a/NIH3T3cells.ThesaturationdensityandthecapabilityofsuppressingapoptosisinWnt3a/NIH3T3cellsweremarkedlyincreased.CONCLOUSION:WesuccessfullyconstructtherecombinantWnt3asignalproteinwithbiologicalactivity.

【Keywords】Wnt3a;eukaryoticexpression;contactinhibition;apoptosis

【摘要】目的：表達(dá)具備生物活性的重組小鼠wnt3a信號(hào)蛋白.方法：應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將重組真核表達(dá)載體pSecTag2/HygroBWnt3a轉(zhuǎn)染并篩選穩(wěn)定表達(dá)的NIH3T3細(xì)胞，WesternBlot鑒定重組Wnt3a蛋白的表達(dá)，并對(duì)Wnt3a/NIH3T3細(xì)胞的融合密度及抗凋亡能力給予檢測(cè).結(jié)果：Wnt3a信號(hào)蛋白在Wnt3a/NIH3T3細(xì)胞中獲得穩(wěn)定表達(dá)，Wnt3a信號(hào)蛋白能夠明顯提高NIH3T3細(xì)胞的融合密度及抗凋亡能力.結(jié)論：在NIH3T3細(xì)胞中表達(dá)的重組Wnt3a信號(hào)蛋白具備生物活性.

【關(guān)鍵詞】Wnt3a；真核表達(dá)；接觸抑制；細(xì)胞凋亡

0引言

小鼠Wnt3a基因是Wnt基因家族中的重要成員，其編碼表達(dá)Wnt3a信號(hào)蛋白.Wnt3a信號(hào)蛋白可以激活經(jīng)典的Wnt/βcatenin信號(hào)通路.Wnt3a信號(hào)蛋白對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的促神經(jīng)元分化的作用.我們應(yīng)用基因重組的方法，從小鼠胚腦中克隆Wnt3acDNA，構(gòu)建真核表達(dá)載體，通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑將目的基因?qū)隢IH3T3細(xì)胞中，建立穩(wěn)定表達(dá)Wnt3a信號(hào)蛋白的NIH3T3細(xì)胞株，并對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行初步分析.

1材料和方法

1.1材料真核表達(dá)載體pSecTag2/HygroBWnt3a由本研究室構(gòu)建.NIH3T3細(xì)胞株由安徽醫(yī)科大學(xué)病理教研室吳強(qiáng)教授惠贈(zèng).多聚賴氨酸購(gòu)自博士德公司；胎牛血清及DMEM購(gòu)自Gibco公司.潮霉素及LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒、購(gòu)自Invitrogen公司.質(zhì)粒小量提取試劑盒WizardPlusSVMiniprepsDNAPurificationsystem,ReverseTranscriptionSystemRTPCR試劑盒購(gòu)自Promega公司；鼠抗mycmAb、鼠抗βcateninmAb購(gòu)自SantaCruz公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的兔抗鼠二抗、TRITC標(biāo)記的兔抗鼠二抗購(gòu)自北京中山公司；臺(tái)盼藍(lán)購(gòu)自sigma公司.其他試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純.

1.2方法

1.2.1NIH3T3細(xì)胞的培養(yǎng)將凍存的NIH3T3細(xì)胞復(fù)蘇后用含100g/L的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃50mL/LCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3d換液1次,傳代3至4次使細(xì)胞達(dá)到良好的生長(zhǎng)狀態(tài).

1.2.2NIH3T3細(xì)胞的轉(zhuǎn)染按LipofectamineTM2000試劑說(shuō)明書操作進(jìn)行.轉(zhuǎn)染前24h用胰蛋白酶消化貼壁的NIH3T3細(xì)胞，再以無(wú)血清及無(wú)雙抗的DMEM培養(yǎng)基重懸，并按1×105的細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至85%～90%融合度時(shí)，取純化的重組質(zhì)粒pSecTag2/HygroBWnt3a2μg，溶于250μL無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基中，得到A液.取3μLLipofectamineTM2000加于97μL無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基中，得到B液.將A,B液混勻，室溫放置30min后加入0.8mL含100g/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，輕輕混勻，均勻滴加于經(jīng)無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌的貼壁細(xì)胞表面，于37℃50mL/LCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h.棄去轉(zhuǎn)染液，加2mL完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng).轉(zhuǎn)染后48h，待細(xì)胞生長(zhǎng)至接近融合時(shí)收集上清，并按1∶3的密度傳代.繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)50%～70%.棄去培養(yǎng)液，更換濃度為600mg/L的潮霉素培養(yǎng)液進(jìn)行篩選.轉(zhuǎn)染時(shí)，設(shè)置轉(zhuǎn)染空載體pSecTag2/HygroB的組和正常細(xì)胞陰性對(duì)照組.約14d后，可見(jiàn)有陽(yáng)性克隆形成，繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng).穩(wěn)定表達(dá)Wnt3a蛋白的細(xì)胞株命名為Wnt3a/NIH3T3（W/3T3），轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞株命名為empty/NIH3T3（E/3T3），正常細(xì)胞陰性對(duì)照組命名為control/NIH3T3（C/3T3）.

1.2.3重組Wnt3a蛋白鑒定轉(zhuǎn)染48h后，分別收集C/3T3,E/3T3和W/3T3細(xì)胞各約1×106及其培養(yǎng)上清液.以SDS煮沸法裂解細(xì)胞并收集上清，并將其與細(xì)胞培養(yǎng)上清液真空冷凍干燥，濃縮至1/2體積，以鼠抗mycmAb為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG為二抗，使用WesternBlot方法行重組Wnt3a蛋白的鑒定.

1.2.4βcatenin的表達(dá)鑒定分別在轉(zhuǎn)染后6,12,24h收集W/3T3,E/3T3及C/3T3細(xì)胞各約1×106，以SDS煮沸法裂解細(xì)胞并收集上清，以鼠抗βcateninmAb為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG為二抗，使用WesternBlot方法進(jìn)行鑒定.

1.2.5Wnt3a/NIH3T3細(xì)胞增殖特性的鑒定以密度約1×105接種W/3T3,E/3T3及C/3T3細(xì)胞于24孔培養(yǎng)板，隔日觀察，臺(tái)盼藍(lán)染色并使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)活細(xì)胞.

1.2.6Wnt3a/NIH3T3細(xì)胞抗凋亡實(shí)驗(yàn)以密度約1×105接種W/3T3,E/3T3及C/3T3細(xì)胞于24孔培養(yǎng)板，24h后臺(tái)盼藍(lán)染色并使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，同時(shí)更換含10g/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，定時(shí)觀察并臺(tái)盼藍(lán)染色并使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)活細(xì)胞，計(jì)算存活細(xì)胞與原始細(xì)胞數(shù)的比值.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析.

2結(jié)果

2.1重組Wnt3a蛋白在的NIH3T3細(xì)胞中獲得表達(dá)WesternBlot鑒定發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt3a基因的NIH3T3細(xì)胞裂解液中有一Mr約為45×103的特異性條帶，在轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt3a基因的NIH3T3細(xì)胞培養(yǎng)上清液、E/3T3及C/3T3細(xì)胞裂解液和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中，均未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)條帶(圖1).

1:W/3T3組細(xì)胞裂解液；2：W/3T3組細(xì)胞培養(yǎng)上清液；3：E/3T3組細(xì)胞裂解液；4：C/3T3組細(xì)胞裂解液.

圖1WestemBlot鑒定Wnt3a信號(hào)蛋白的表達(dá)（略）

2.2Wnt3a/NIH3T3細(xì)胞中βcatenin的表達(dá)上調(diào)對(duì)Wnt信號(hào)通路中的重要信息分子βcatenin的表達(dá)情況進(jìn)行WesternBlot鑒定，在Mr約90×103處出現(xiàn)特異性條帶(圖2)，但無(wú)時(shí)間依賴性.

1~3:培養(yǎng)6,12,24h.

圖2各實(shí)驗(yàn)組βcatenin表達(dá)（略）

2.3Wnt3a/NIH3T3細(xì)胞融合密度明顯增高經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，以密度約1×105接種的E/3T3及C/3T3細(xì)胞3d后生長(zhǎng)至融合密度，此時(shí)細(xì)胞融合密度約4.6×105，但W/3T3細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)至第6d，細(xì)胞融合密度約13×105，與另外兩組相比，W/3T3細(xì)胞融合密度明顯增高（P<0.01）(圖3，4).

A：W/3T3；B：E/3T3；C：C/3T3.

圖3各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞融合密度觀察(倒置×100)（略）

2.4W/3T3細(xì)胞抗凋亡能力明顯增高經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，更換含10g/L胎牛血清的培養(yǎng)液48h后，E/3T3及C/3T3細(xì)胞大量凋亡，細(xì)胞數(shù)明顯減少，但W/3T3細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯減少，抗凋亡能力明顯提高（P<0.01）(圖5，6).

圖4實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)變化（略）

A：W/3T3；B：E/3T3；C：C/3T3.

圖5各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞抗凋亡能力觀察(倒置×100)（略）

圖6實(shí)驗(yàn)組存活細(xì)胞比例（略）

3討論

Wnt信號(hào)蛋白為含有23～24個(gè)保守型半胱氨酸殘基,在人類的基因組中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Wnt基因19種［1-2］.Wnt3a是Wnt基因家族的重要成員，其基因早在1992年就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，而且多種的真核細(xì)胞被用于它的表達(dá)，但由于其低溶解度及疏水性等特點(diǎn)，一直未能純化出具備生物活性的Wnt3a信號(hào)蛋白.1998年，Shibamoto等［3］使用L細(xì)胞（鼠胸腺激酶缺陷細(xì)胞株；LMTK）作為表達(dá)細(xì)胞時(shí)，在培養(yǎng)上清中發(fā)現(xiàn)了大量具備生物活性的Wnt3a蛋白，約400μg/L.Willert等［4］所純化的Wnt3a信號(hào)蛋白通過(guò)激活Wnt信號(hào)通路促使骨髓中的造血干細(xì)胞分裂和自我復(fù)制，認(rèn)為Wnt可能在一系列組織的自我更新中起信號(hào)作用.

βcatenin是經(jīng)典的Wnt/βcatenin信號(hào)通路中重要的信息分子［5］，其在Wnt信號(hào)通路關(guān)閉的情況下，βcatenin被磷酸化而迅速降解.Wnt信號(hào)通路被激活后，βcatenin在胞內(nèi)大量聚集，并進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng).βcatenin表達(dá)的明顯上調(diào)代表Wnt信號(hào)通路被激活.實(shí)驗(yàn)中WesternBlot鑒定發(fā)現(xiàn)βcatenin表達(dá)明顯上調(diào)，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與時(shí)間有依賴關(guān)系.實(shí)驗(yàn)中表達(dá)的重組Wnt3a信號(hào)蛋白帶有myc標(biāo)簽，Burrus等［6］認(rèn)為如果Wnt3a信號(hào)蛋白帶有標(biāo)簽將影響其活性，甚至失活.但同樣有文獻(xiàn)［7,8］中應(yīng)用的Wnt3a信號(hào)蛋白帶有myc,HA等標(biāo)簽，而且文獻(xiàn)中對(duì)其活性同樣做了詳細(xì)的描述.本實(shí)驗(yàn)夠構(gòu)建的重組Wnt3a信號(hào)蛋白具備生物學(xué)活性，但未能與野生型（wildtype）Wnt3a信號(hào)蛋白活性做詳細(xì)的比較，其生物學(xué)活性的變化有待進(jìn)一步分析.

Wnt3a蛋白可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化.在使用含有Wnt3a信號(hào)蛋白的條件培養(yǎng)液培養(yǎng)E11.5d的胎鼠前腦神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)干細(xì)胞大量分化成為MAP2陽(yáng)性的神經(jīng)元.去除Wnt3a信號(hào)蛋白后，神經(jīng)干細(xì)胞恢復(fù)增殖能力，而且當(dāng)條件培養(yǎng)液中的FGF2去除后，分化的神經(jīng)元形態(tài)更為成熟［8-9］.來(lái)源于小鼠大腦皮質(zhì)的神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)基因后超表達(dá)Wnt信號(hào)蛋白，即使在培養(yǎng)液中加入FGF2，依然大量向神經(jīng)元分化，但阻斷Wnt信號(hào)通路后神經(jīng)元的分化被抑制［10］.

Wnt信號(hào)通路的生物學(xué)作用十分復(fù)雜，不同的Wnt基因，不同的細(xì)胞，甚至不同的細(xì)胞狀態(tài)都有可能產(chǎn)生不同的作用［11］.在本實(shí)驗(yàn)中我們采用pSecTag2/HygroBWnt3a真核表達(dá)載體，NIH3T3細(xì)胞作為表達(dá)細(xì)胞，成功表達(dá)重組Wnt3a信號(hào)蛋白，初步探討了Wnt3a信號(hào)蛋白的生物學(xué)活性，為進(jìn)一步建立用于以治療為目的的分子移植的方法奠定基礎(chǔ).

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