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篇1

【關(guān)鍵詞】污染土壤；微生物；修復(fù)原理；修復(fù)技術(shù)

土壤污染已經(jīng)成為全球性的重要環(huán)境問題之一。由于礦山開采、金屬冶煉以及工業(yè)污水和污泥的農(nóng)業(yè)應(yīng)用，大量的有毒有害重金屬元素進(jìn)入土壤系統(tǒng)，在土壤中的滯留時(shí)間長，具有難降解性、隱蔽性和不可逆性的特點(diǎn)，不僅導(dǎo)致土壤的退化、農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的降低，而且還可能通過食物鏈危及人類的健康和生命。

目前，用于土壤重金屬污染治理的方法包括物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)和生物修復(fù)。物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)雖能達(dá)到一定的效果，但是能耗大、二次污染等問題也限制了其應(yīng)用[1]，尤其對(duì)于大面積有害的低濃度重金屬污染，更是難以處理。重金屬污染土壤的原位生物修復(fù)是利用各種天然生物過程而發(fā)展起來的一種現(xiàn)場處理土壤環(huán)境污染的技術(shù)，可利用生物削減土壤中重金屬含量或降低重金屬毒性[2]。根據(jù)修復(fù)主體的不同，它主要分為微生物修復(fù)、植物修復(fù)和植物-微生物聯(lián)合修復(fù)。微生物修復(fù)較物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)有著無可比擬的優(yōu)越性，操作簡單、處理費(fèi)用低、效果好，對(duì)環(huán)境不會(huì)造成二次污染，可以就地進(jìn)行處理等，具有很大的潛力和廣闊的應(yīng)用前景。

1.微生物修復(fù)機(jī)理

重金屬對(duì)人的毒性作用常與它的存在狀態(tài)有密切的關(guān)系。一般地說，金屬存在形式不同，其毒性作用也不同。微生物不能降解和破壞重金屬，但可以對(duì)土壤中的重金屬進(jìn)行固定、移動(dòng)或轉(zhuǎn)化，改變它們?cè)谕寥乐械沫h(huán)境化學(xué)行為，可促進(jìn)有毒、有害物質(zhì)解毒或降低毒性，從而達(dá)到生物修復(fù)的目的。

1.1 微生物的轉(zhuǎn)化作用

微生物對(duì)重金屬的轉(zhuǎn)化作用包括氧化還原作用、甲基化與去甲基化作用以及重金屬的溶解和有機(jī)絡(luò)合配位降解。土壤中的一些重金屬元素可以多種價(jià)態(tài)和形態(tài)存在，不同價(jià)態(tài)和形態(tài)的溶解性和毒性不同，可通過微生物的氧化還原作用和去甲基化作用改變其價(jià)態(tài)和形態(tài)，從而改變其毒性和移動(dòng)性。

1.1.1 氧化還原作用

微生物可通過改變重金屬的氧化還原狀態(tài)，使重金屬化合價(jià)發(fā)生變化，改變重金屬的穩(wěn)定性。Silver等[3]提出，在細(xì)菌作用下氧化還原是最有希望的有毒廢物生物修復(fù)系統(tǒng)。微生物能氧化土壤中多種重金屬元素，某些自養(yǎng)細(xì)菌如硫-鐵桿菌類 （Thiobacillus ferrobacillus）能氧化As、Cu、Mo和Fe等，假單孢桿菌屬 （Pseudomonas）能使As、Fe和Mn等發(fā)生生物氧化，降低這些重金屬元素的活性。微生物對(duì)重金屬的轉(zhuǎn)化作用常見的有對(duì)鉻、汞、硒和砷等的轉(zhuǎn)化。如假單胞菌（ Pseudomonadsp.） 可以把六價(jià)鉻還原為三價(jià)鉻，從而降低其毒性[4]。

1.1.2 甲基化與去甲基化作用

微生物可通過改變重金屬的甲基化和去甲基化作用改變重金屬的環(huán)境效應(yīng)。Fwukowa從土壤中得到假單胞桿菌K-62，它能分解無機(jī)汞和有機(jī)汞而形成元素汞，元素汞的生物毒性比無機(jī)汞和有機(jī)汞低得多。Frankenber等通過耕作、優(yōu)化管理、施加添加劑等來加速硒的原位生物甲基化，使其揮發(fā)而降低硒的毒性，此生物技術(shù)已在美國西部灌溉農(nóng)業(yè)中用于清除硒污染[5]。有些真菌和細(xì)菌能使無機(jī)As轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性有機(jī)As，從而降低其毒性[6]。

1.1.3 重金屬溶解或配位絡(luò)合作用

一些微生物，如動(dòng)膠菌、藍(lán)細(xì)菌、硫酸鹽還原菌以及某些藻類，能夠產(chǎn)生胞外聚合物如多糖、糖蛋白等具有大量的陰離子基團(tuán)，與重金屬離子形成絡(luò)合物。如Bargagli在Hg礦附近土壤中分離得到很多高級(jí)真菌，一些菌根種和所有腐殖質(zhì)分解菌都能積累Hg達(dá)到100 mg/kg土壤干重[7]。

1.2 微生物的積累和吸著作用

土壤中重金屬離子有5種形態(tài)：可交換態(tài)、碳酸鹽結(jié)合態(tài)、鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)、有機(jī)結(jié)合態(tài)、殘?jiān)鼞B(tài)。前3種形態(tài)穩(wěn)定性差，后2種形態(tài)穩(wěn)定性強(qiáng)。重金屬污染物的危害主要來自前3種不穩(wěn)定的重金屬形態(tài)[6]。微生物固定作用可將重金屬離子轉(zhuǎn)化為后兩種形態(tài)或積累在微生物體內(nèi)，從而使土壤中重金屬的濃度降低或毒性減小。微生物固定作用有胞外吸附作用、胞外沉淀作用和胞內(nèi)積累作用3種形式。其作用方式有以下幾種：①金屬磷酸鹽、金屬硫化物沉淀；②細(xì)菌胞外多聚體；③金屬硫蛋白、植物螯合肽和其他金屬結(jié)合蛋白；④鐵載體；⑤真菌來源物質(zhì)及其分泌物對(duì)重金屬的去除[8]。

1.2.1 胞外吸附作用

胞外吸附作用主要是指重金屬離子與微生物的產(chǎn)物或細(xì)胞壁表面的一些基團(tuán)通過絡(luò)合、螯合、離子交換、靜電吸附、共價(jià)吸附等作用中的一種或幾種相結(jié)合的過程[2]。許多研究表明細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物對(duì)溶解態(tài)的金屬離子有很強(qiáng)的絡(luò)合能力，這主要因?yàn)榧?xì)菌表面有獨(dú)特的化學(xué)組成。細(xì)胞壁帶有負(fù)電荷而使整個(gè)細(xì)菌表面帶負(fù)電荷，而細(xì)菌的產(chǎn)物或細(xì)胞壁表面的一些基團(tuán)如-COOH、-NH2、-SH、-OH等陰離子可以增加金屬離子的絡(luò)合作用[9]。研究表明，許多微生物，包括細(xì)菌、真菌和藻類可以生物積累（bioaccumulation）和生物吸著 （biosorption）環(huán)境中多種重金屬和核素[10]。一些微生物如動(dòng)膠菌、藍(lán)細(xì)菌、硫酸鹽還原菌以及某些藻類，能夠產(chǎn)生胞外聚合物如多糖、糖蛋白等具有大量的陰離子基團(tuán)，與重金屬離子形成絡(luò)合物。

1.2.2 胞外沉淀作用

胞外沉淀作用指微生物產(chǎn)生的某些代謝產(chǎn)物與重金屬結(jié)合形成沉淀的過程。在厭氧條件下，硫酸鹽還原菌中的脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）和腸狀菌屬（Desulfotomaculum）可還原硫酸鹽生成硫化氫，硫化氫與Hg2+形成HgS沉淀，抑制了Hg2+的活性[11]。某些微生物產(chǎn)生的草酸與重金屬形成不溶性草酸鹽沉淀。

1.2.3 胞內(nèi)積累作用

胞內(nèi)積累作用是指重金屬被微生物吸收到細(xì)胞內(nèi)而富集的過程。重金屬進(jìn)入細(xì)胞后，通過區(qū)域化作用分布在細(xì)胞內(nèi)的不同部位，微生物可將有毒金屬離子封閉或轉(zhuǎn)變成為低毒的形式[12]。微生物細(xì)胞內(nèi)可合成金屬硫蛋白，金屬硫蛋白與Hg、Zn、Cd、Cu、Ag 等重金屬有強(qiáng)烈的親合性，結(jié)合形成無毒或低毒絡(luò)合物。如真菌木霉、小刺青霉和深黃被包霉通過區(qū)域化作用對(duì)Cd、Hg都有很強(qiáng)的胞內(nèi)積累作用[13]。研究表明，微生物的重金屬抗性與MT積累呈正相關(guān)，這使細(xì)菌質(zhì)粒可能有抗重金屬的基因，如丁香假單胞菌和大腸桿菌均含抗 Cu基因，芽孢桿菌和葡萄球菌含有抗Cd和抗Zn基因，產(chǎn)堿菌含抗Cd、抗 Ni及抗Co基因，革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌中含抗As和抗Sb基因。Hiroki[14]發(fā)現(xiàn)在重金屬污染土壤中加入抗重金屬產(chǎn)堿菌可使得土壤水懸浮液得以凈化?？梢?，微生物生物技術(shù)在凈化污染土壤環(huán)境方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

2.重金屬污染土壤微生物修復(fù)技術(shù)及其研究進(jìn)展

微生物修復(fù)重金屬污染的技術(shù)主要為原位修復(fù)和異位修復(fù)。微生物原位修復(fù)技術(shù)是指不需要將污染土壤搬離現(xiàn)場，直接向污染土壤投放N、P等營養(yǎng)物質(zhì)和供氧，促進(jìn)土壤中土著微物或特異功能微生物的代謝活性，降解污染物主要包括：生物通風(fēng)法（bioventing）、生物強(qiáng)化法（enhanced-bioremediation）、土地耕作法（1and farming）和化學(xué)活性柵修復(fù)法（chemical activated bar）等幾種。異位微生物修復(fù)是把污染土壤挖出，進(jìn)行集中生物降解的方法。主要包括預(yù)制床法（preparedbed）、堆制法（composting biorernediation）及泥漿生物反應(yīng)器法（bioslutrybioreactor）。

2.1 生物刺激技術(shù)

生物刺激即向污染的土壤中添加微生物生長所需的氮、磷等營養(yǎng)元素以及電子受體，刺激土著微生物的生長來增加土壤中微生物的數(shù)量和活性。關(guān)于這方面的研究國外文獻(xiàn)已有報(bào)道。Reddy KR，Cutright T J對(duì)鉻污染土壤的微生物修復(fù)進(jìn)行的研究表明，限制鉻污染場地修復(fù)進(jìn)程的一個(gè)共同因素是污染場地通常缺乏足夠的營養(yǎng)以供引進(jìn)的外來微生物或土著微生物生長，以至這些微生物自身具備的還原Cr6+的潛力得不到充分發(fā)揮；為使其潛力得到充分發(fā)揮，需向其生活的環(huán)境中投加營養(yǎng)物質(zhì)來刺激鉻還原菌的新陳代謝和繁殖，促進(jìn)鉻污染土壤的修復(fù)[15]。HigginsT E將堆肥、鮮肥、牛糞、泥炭加入鉻污染土壤進(jìn)行原位修復(fù)，提高了修復(fù)效果[16]。

2.2 生物強(qiáng)化技術(shù)

生物強(qiáng)化技術(shù)即向重金屬污染土壤中加入一種高效修復(fù)菌株或由幾種菌株組成的高效微生物組群來增強(qiáng)土壤修復(fù)能力的技術(shù)。所加入的高效菌株可通過篩選培育或通過基因工程構(gòu)建，也可以通過微生物表面展示技術(shù)表達(dá)重金屬高效結(jié)合肽，從而得到高效菌株。

2.2.1 高效菌株篩選

高效菌株有2個(gè)來源：一是從重金屬污染土壤中篩選；二是從其他重金屬污染環(huán)境中篩選。從重金屬污染土壤中篩選分離出土著微生物，將其富集培養(yǎng)后再投入到原污染的土壤，這是本土生物強(qiáng)化技術(shù)（本土生物強(qiáng)化技術(shù)是由日本科學(xué)家Ueno A等人于2007年首次提出的[17]）。篩選、富集的土著微生物更能適應(yīng)土壤的生態(tài)條件，進(jìn)而更好地發(fā)揮其修復(fù)功能。目前已從Cr（VI）、Zn、Pb污染土壤中篩選分離出菌種Pseudo-monasmesophillca和maltophiliaP，Barton等對(duì)這2種菌株去除Se、Pb毒性的可能性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)上述菌種均能將硒酸鹽、亞硒酸鹽和二價(jià)鉛轉(zhuǎn)化為不具毒性且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的膠態(tài)硒與膠態(tài)鉛。Robinson等研究了從土壤中篩選的4種熒光假單胞菌對(duì)Cd的富集與吸收效果，發(fā)現(xiàn)這4種細(xì)菌對(duì)Cd的富集達(dá)到環(huán)境中的100倍以上[1]。

2.2.2 基因工程菌構(gòu)建

基因工程可以打破種屬的界限，把重金屬抗性基因或編碼重金屬結(jié)合肽的基因轉(zhuǎn)移到對(duì)污染土壤適應(yīng)性強(qiáng)的微生物體內(nèi)，構(gòu)建高效菌株。由于大多數(shù)微生物對(duì)重金屬的抗性系統(tǒng)主要由質(zhì)粒上的基因編碼，且抗性基因亦可在質(zhì)粒與染色體間相互轉(zhuǎn)移，許多研究工作開始采用質(zhì)粒來提高細(xì)菌對(duì)重金屬的累積作用，并取得了良好的應(yīng)用效果[18]。

2.2.3 微生物表面展示技術(shù)

微生物表面展示技術(shù)是將編碼目的肽的DN段通過基因重組的方法構(gòu)建和表達(dá)在噬菌體表面、細(xì)菌表面（如外膜蛋白、菌毛及鞭毛）或酵母菌表面（如糖蛋白），從而使每個(gè)顆粒或細(xì)胞只展示一種多肽[19]。微生物表面展示技術(shù)可以把編碼重金屬離子高效結(jié)合肽的基因通過基因重組的方法與編碼細(xì)菌表面蛋白的基因相連，重金屬離子高效結(jié)合肽以融合蛋白的形式表達(dá)在細(xì)菌表面，可以明顯增強(qiáng)微生物的重金屬結(jié)合能力，這為重金屬污染的防治提供了一條嶄新的途徑。

LamB、冰晶蛋白、凝集素、a-凝集素和葡萄球菌蛋白A都是表面蛋白，在微生物表面展示技術(shù)中用來定位、錨定外源多肽[20-21]。Sousa C等將六聚組氨酸多肽展示在E.coliLamB蛋白表面，可以吸附大量的金屬離子，重組菌株對(duì)Cd2+的吸附和富集比E.coli大11倍[22]；Xu Z、Lee S Y將多聚組氨酸（162個(gè)氨基酸） 與Omp C融合，重組菌株吸附Cd的能力達(dá)32 mol/ g干菌[23]；Schembri M A等將隨機(jī)肽庫構(gòu)建于E.coli 的表面菌毛蛋白FimH粘附素上，經(jīng)數(shù)輪篩選和富集，獲得對(duì)PbO2、CoO、MnO2、Cr2O3具有高親和力的多肽[24]；KurodaK、UedM將酵母金屬硫蛋白（YMT） 串聯(lián)體在酵母表面展示表達(dá)后，四聚體對(duì)重金屬吸附能力提高5.9倍，八聚體提高8.7倍[25]。表面展示技術(shù)用于重金屬污染土壤原位修復(fù)的研究雖然取得了許多成果，但離實(shí)際應(yīng)用尚有一段距離。其主要原因是用于展示金屬結(jié)合肽的受體微生物種類及適應(yīng)性有限，并且缺乏選擇金屬結(jié)合肽的有效方法[19]。

3. 結(jié)論與展望

從目前來看，微生物修復(fù)是最具發(fā)展和應(yīng)用前景的生物修復(fù)技術(shù)，人們?cè)谖⑸锊牧?、降解途徑以及修?fù)技術(shù)研發(fā)等方面取得了一定的研究進(jìn)展，并展示了一些成功的修復(fù)案例。但重金屬污染土壤原位微生物修復(fù)技術(shù)目前還存在以下幾個(gè)方面的問題：（1）修復(fù)效率低，不能修復(fù)重污染土壤。（2）加入到修復(fù)現(xiàn)場中的微生物會(huì)與土著菌株競爭，可能因其競爭不過土著微生物，而導(dǎo)致目標(biāo)微生物數(shù)量減少或其代謝活性喪失。（3）重金屬污染土壤原位微生物修復(fù)技術(shù)大多還處于研究階段和田間試驗(yàn)與示范階段，還存在大規(guī)模實(shí)際應(yīng)用的問題。（4）微生物個(gè)體微小，難以從土壤中分離；重金屬回收困難。

污染場地應(yīng)用是各種生物修復(fù)技術(shù)研發(fā)的最終目的。一般說來，實(shí)驗(yàn)室的微生物修復(fù)研究，因修復(fù)條件較為理想化，擾因素極少，其修復(fù)可能很好。如一旦將室內(nèi)的微生物修復(fù)技術(shù)放大到現(xiàn)場條件下，干擾因素復(fù)雜，一系列的新問題可能會(huì)出現(xiàn)，甚至可能會(huì)遭致完全否定等現(xiàn)象。因此，微生物修復(fù)技術(shù)的場地應(yīng)用是一項(xiàng)復(fù)雜的系統(tǒng)工程，必須融合環(huán)境工程、水利學(xué)、環(huán)境化學(xué)及土壤學(xué)等多學(xué)科知識(shí)，創(chuàng)造現(xiàn)場的修復(fù)條件，如土地翻耕、農(nóng)藝措施、添加物質(zhì)、高效微生物、植物修復(fù)，季節(jié)更替等，構(gòu)建出一套因地因時(shí)的污染土壤田間修復(fù)工程技術(shù)。

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篇2

甲硫氨酸是繼谷氨酸之后產(chǎn)量第二大的氨基酸，2011年，針對(duì)動(dòng)物飼料的甲硫氨酸市場年銷售額約28.5億美元，銷量85萬噸，年增長率5%。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2014年全球甲硫氨酸需求量約100萬噸，呈逐年增長趨勢。目前甲硫氨酸三大主要生產(chǎn)商為贏創(chuàng)（原德固賽）公司，安迪蘇（原普朗克）公司和日本曹達(dá)（原孟山都）公司[6]。2006年，中國藍(lán)星有限公司收購安迪蘇子公司，并于2010年在江蘇南京開始建廠，將最初年產(chǎn)能7萬噸的計(jì)劃翻倍至14萬噸。該廠的建成投產(chǎn)將結(jié)束中國重要?jiǎng)游镲暳咸砑觿┩耆蕾囘M(jìn)口的局勢。贏創(chuàng)公司2011年12月決議，在新加坡建立產(chǎn)能15萬噸的甲硫氨酸加工廠，將在2014年第三季度投入生產(chǎn)。韓國杰希公司和法國阿科瑪公司于2012年宣布將在東南亞建立產(chǎn)能8萬噸的甲硫氨酸加工廠，該廠將采用全新的發(fā)酵-化學(xué)法聯(lián)合生產(chǎn)線。德國巴斯夫公司雖然于2007年申請(qǐng)了發(fā)酵生產(chǎn)甲硫氨酸的專利，但至今仍不適用于商業(yè)生產(chǎn)。法國邁陀保利克公司和羅蓋特公司合作致力于L-甲硫氨酸發(fā)酵產(chǎn)品的研發(fā)[6]。

2生物技術(shù)生產(chǎn)甲硫氨酸研究進(jìn)展

2.1微生物發(fā)酵路線的相關(guān)研究

2.1.1甲硫氨酸生物合成途徑的研究

為構(gòu)建甲硫氨酸生產(chǎn)菌，首先需要了解甲硫氨酸的生物合成途徑，其中最基本的氨基酸生產(chǎn)菌——大腸桿菌(Escherichiacoli)和谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)成為研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。如圖1，細(xì)菌中甲硫氨酸合成途徑以天冬氨酸為起點(diǎn)，經(jīng)天冬氨酸激酶(aspartokinase，AK)和高絲氨酸脫氫酶(homoserinedehydrogenase，HSD)兩個(gè)限速酶催化，生成高絲氨酸，進(jìn)而分別合成蘇氨酸和甲硫氨酸。甲硫氨酸合成存在兩個(gè)途徑：巰基轉(zhuǎn)移途徑以胱硫醚為中間體，以半胱氨酸為硫源，而直接巰基化途徑則可利用無機(jī)硫源。大腸桿菌只通過巰基轉(zhuǎn)移途徑合成甲硫氨酸，谷氨酸幫桿菌可同時(shí)利用兩個(gè)途徑。2002年Hwang等[14]在谷氨酸棒桿菌中發(fā)現(xiàn)了甲硫氨酸生物合成的直接巰基化途徑，并對(duì)metY或metB進(jìn)行突變，比較突變株生長參數(shù)。兩種酶在序列上存在相似性，但微生物優(yōu)先選擇巰基轉(zhuǎn)移途徑。因此它們?cè)谶M(jìn)化上可能來自同一種酶，而MetY是長期進(jìn)化過程中突變和自然選擇的結(jié)果，存在受甲硫氨酸反饋抑制、與底物親和性低的缺陷。2007年，該課題組[15]對(duì)MetB和MetY進(jìn)行純化，比較了二者的生化參數(shù)。發(fā)現(xiàn)MetB和MetY對(duì)O-乙酰高絲氨酸催化作用的Km值分別為3.9和6.4mmol/L，與之前的推測吻合。同時(shí)，MetY對(duì)硫化物離子的Km也過高，證明其與硫化物離子的結(jié)合也很微弱，溫度和pH耐受性也較MetB差。至此，MetY存在的生理意義和利用價(jià)值尚不明晰。2006年，Krmer等[16]在對(duì)大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌甲硫氨酸代謝途徑進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，以甲硫醇為硫源時(shí)，NADPH的消耗減少，可使甲硫氨酸理論產(chǎn)量得到提高。以甲硫醇或其二聚體二甲基二硫?yàn)榱蛟吹脑硎菍⑵?S-CH3基團(tuán)完整地插入甲硫氨酸的R基而直接生成甲硫氨酸。這一理論在2010年被Bolten等[17]證實(shí)，并通過基因敲除和14C同位素示蹤實(shí)驗(yàn)證明，催化這一反應(yīng)的酶正是MetY。至此，MetY這一獨(dú)特功能為該領(lǐng)域的研究提供了全新的線索。

2.1.2甲硫氨酸生產(chǎn)菌選育的相關(guān)研究

除發(fā)酵常用的谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌之外，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、百合棒桿菌(Corynebacteriumlilium)也常用作改造的出發(fā)菌株。2012年，Dike等[3]從不同土樣中篩選出三株蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)RS-16，DS-13,和AS-9，其中最優(yōu)菌株RS-16經(jīng)96h發(fā)酵產(chǎn)甲硫氨酸1.84mg/mL。但野生型菌株氨基酸的生物合成受到嚴(yán)格的代謝調(diào)控，一般不能滿足大量生產(chǎn)氨基酸的需要。因此，需要人為打破微生物對(duì)甲硫氨酸生物合成的代謝調(diào)節(jié)。篩選抗結(jié)構(gòu)類似物菌株和營養(yǎng)缺陷型菌株是最常用的育種方法。2003年，Kumar等[18]采用紫外和亞硝基胍誘變技術(shù)處理百合屬棒桿菌，篩選獲得M-128菌株，其甲硫氨酸產(chǎn)量為2.3g/L；2009年，閔偉紅等[19-20]通過抗結(jié)構(gòu)類似物的篩選獲得北京棒桿菌(Corynebacteriumpekinense)突變株E31，其甲硫氨酸產(chǎn)量達(dá)1.479g/L。2011年，該課題組以E31為出發(fā)菌株，采用復(fù)合誘變和青霉素濃縮法篩選獲得12株賴氨酸和蘇氨酸雙重營養(yǎng)缺陷型突變株，其中突變株GE37的甲硫氨酸產(chǎn)量達(dá)3.55g/L。這些傳統(tǒng)的改造方法機(jī)理難以闡明，工作量大，但突變?nèi)?、有效。隨著基因技術(shù)的發(fā)展，2007年，Park等[1]解除了蘇氨酸對(duì)HSD的反饋抑制，同時(shí)敲除了thrB基因，阻止蘇氨酸合成。分批發(fā)酵過程中甲硫氨酸產(chǎn)量達(dá)2.9g/L。2011年，Chen等[21]利用分子動(dòng)力學(xué)模擬與統(tǒng)計(jì)耦合分析相結(jié)合鑒別出30個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基，并證明這些殘基的突變可在不同程度上解除大腸桿菌AKⅢ的反饋抑制。至此，對(duì)于兩大限速酶的研究逐漸趨于半理性，能在代謝和進(jìn)化水平上做出合理的解釋，改造目標(biāo)更明確。在菌種選育過程中，一些新發(fā)現(xiàn)也給研究人員以啟示。2005年，Mampel等[22]對(duì)谷氨酸棒桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)座子誘變，得到7000個(gè)具有乙硫氨酸抗性的突變株，轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)為ORFNCgl2640，NCl2640失活會(huì)導(dǎo)致甲硫氨酸產(chǎn)量增加，證明該位點(diǎn)與L-甲硫氨酸合成途徑中某種抑制的解除密切相關(guān)。其結(jié)構(gòu)和具體功能有待科研工作者深入研究。2010年，Bolten等[17]發(fā)現(xiàn)了MetY的獨(dú)特功能后，試圖對(duì)MetY進(jìn)行過表達(dá)以增加甲硫氨酸產(chǎn)量，結(jié)果MetY酶活力提高近30倍，但發(fā)酵液中并無甲硫氨酸，胞內(nèi)甲硫氨酸產(chǎn)量也只提高2倍。胞內(nèi)組分分析發(fā)現(xiàn)其底物O-乙酰高絲氨酸已完全耗盡。這說明半理性的單基因修飾難以保證整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)的平衡，以途徑中各代謝物和酶的功能性質(zhì)及代謝流分布信息為基礎(chǔ)，更加理性化的多基因修飾成為下一階段的研究目標(biāo)。2002年BiranD發(fā)現(xiàn)大腸桿菌[23]中MetA極易被四種依賴ATP催化的蛋白酶水解，且該基因受熱轉(zhuǎn)錄休克調(diào)控。2013年，Dike等[24]對(duì)根癌土壤桿菌中MetA進(jìn)行表征時(shí)發(fā)現(xiàn)了相同的不穩(wěn)定性和極端不耐熱特性。這極有可能也是賴氨酸和蘇氨酸易發(fā)酵生產(chǎn)，在同一途徑下游的甲硫氨酸卻一直難以實(shí)現(xiàn)發(fā)酵生產(chǎn)的重要原因。

2.1.3甲硫氨酸向胞外輸出的研究

發(fā)酵法生產(chǎn)甲硫氨酸在合成水平上不易達(dá)到增產(chǎn)目標(biāo)，即便細(xì)胞質(zhì)內(nèi)甲硫氨酸產(chǎn)量得到提高，釋放至培養(yǎng)液中的量卻極少?？偨Y(jié)有以下兩方面原因：①微生物自身調(diào)控嚴(yán)格，為趨利避害，甲硫氨酸在自然條件下不會(huì)過量積累，即使經(jīng)改造的菌株，甲硫氨酸的產(chǎn)量與微生物細(xì)胞適應(yīng)性之間的平衡也難把握。②即使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)甲硫氨酸過量積累，但其輸出體系不完善，產(chǎn)物被微生物自身再利用或直接傷害細(xì)胞。2005年，Trtschel等[25]在已經(jīng)提高了胞內(nèi)甲硫氨酸濃度的條件下，利用DNA微陣列技術(shù)識(shí)別出過量表達(dá)的膜蛋白基因brnF（編碼BrnFE中較大的亞基），之前研究表明其與異亮氨酸輸出體系有關(guān)。當(dāng)BrnFE的合成被氯霉素關(guān)閉時(shí)，仍能觀察到大量甲硫氨酸輸出，只有極大提高氯霉素水平，其輸出才會(huì)減弱。這說明甲硫氨酸輸出體系不止一個(gè)，還存在不易被識(shí)別、但輸出能力高的其它體系。發(fā)掘并擴(kuò)增輸出通道既可增加發(fā)酵液中甲硫氨酸產(chǎn)量，又能避免代謝物積累對(duì)微生物的損傷。

2.1.4發(fā)酵條件的相關(guān)研究

對(duì)于甲硫氨酸發(fā)酵，最特殊的培養(yǎng)基成分即硫和甲基。以谷氨酸棒桿菌為例，2006年，Krmer等[16]用計(jì)算機(jī)模擬了不同硫源在甲硫氨酸合成途徑中的應(yīng)用。以硫酸鹽為硫源通過直接巰基化途徑生成1mol甲硫氨酸消耗8molNADPH，巰基轉(zhuǎn)移途徑消耗9molNADPH，而以硫代硫酸鹽為硫源，整個(gè)代謝過程只需要5.5molNADPH，以硫化物為硫源，NADPH消耗量僅為硫酸鹽的一半。但PPP途徑和TCA循環(huán)所能提供的NADPH是固定的，因此不同硫源的利用效率有待在實(shí)踐中考證。硫與甲基來源的結(jié)合可以考慮比較硫代硫酸鹽與甲酸鹽、硫化物與甲酸鹽及甲硫醇的利用情況。除了這兩種關(guān)鍵組分，2014年，Anakwenze等[26]從發(fā)酵的油豆種子中分離出甲硫氨酸產(chǎn)量為1.89mg/ml的赤云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)EC1，對(duì)發(fā)酵總體積、接種量、碳源及氮源濃度、促生長物質(zhì)均進(jìn)行探索優(yōu)化，最終赤云金芽孢桿菌EC1甲硫氨酸的產(chǎn)量可以達(dá)到3.18mg/mL。對(duì)于發(fā)酵工藝的探索一直是實(shí)際生產(chǎn)中的關(guān)鍵。Sharma等[27]研究了百合棒桿菌產(chǎn)甲硫氨酸中稀釋速率與溶解氧對(duì)甲硫氨酸產(chǎn)量的影響。最終確定當(dāng)稀釋速率為0.16、溶氧為42%時(shí)，甲硫氨酸生產(chǎn)速率最大值為160mg/(L•h)。2012年，賈翠英等[28]研究了不同破壁方法對(duì)細(xì)菌甲硫氨酸產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，經(jīng)堿破壁、溶菌酶破壁，超聲波破壁、堿與超聲波復(fù)合破壁、溶菌酶與超聲波復(fù)合破壁后，甲硫氨酸產(chǎn)量分別提高10.9%、12%、18.3%、19.6%、22.2%。這種工藝可以將胞內(nèi)甲硫氨酸釋放出來，增加收率，復(fù)合破壁比單一破壁效果更顯著。

2.2酶法生產(chǎn)路線的相關(guān)研究

2.2.1外消旋混合物拆分生產(chǎn)甲硫氨酸

酶法拆分又分為兩種思路，傳統(tǒng)的拆分是消除外消旋混合物中的D-甲硫氨酸，另一種路線將D型轉(zhuǎn)化為L型，純化的同時(shí)也增加了產(chǎn)量無疑是更理想的選擇。2007年，F(xiàn)indrik等[29]利用原玻璃蠅節(jié)桿菌(Arthrobacterprotophormiae)中D-氨基酸氧化酶、過氧化氫酶、紅球菌(Rhodococcus)中L-苯丙氨酸脫氫酶、博伊丁假絲酵母(Candidaboidinii)中甲酸脫氫酶串聯(lián)實(shí)現(xiàn)D-甲硫氨酸向L-甲硫氨酸的完全轉(zhuǎn)化。更具意義的是，D-氨基酸氧化酶和L-苯丙氨酸脫氫酶可以作用于不同的底物，因此，該體系也適用于其它D型氨基酸及某種氨基酸外消旋體向L型的轉(zhuǎn)化合成。

2.2.2化合物酶解生產(chǎn)甲硫氨酸

2014年，Jin等[30]對(duì)大腸桿菌中經(jīng)密碼子優(yōu)化的腈水解酶基因進(jìn)行重新合成和表達(dá)，從而有效利用2-氨基-4-甲硫基丁腈水解生產(chǎn)甲硫氨酸。并在催化劑充足的情況下，以固定的底物/催化劑比值探索底物最佳濃度。該課題組也對(duì)在填充床反應(yīng)器中利用固定化靜息細(xì)胞生產(chǎn)甲硫氨酸進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示固定化腈水解酶100h后活性仍大于80%，甲硫氨酸總回收率達(dá)97%。該項(xiàng)研究表明，重組腈水解酶應(yīng)用于甲硫氨酸生產(chǎn)具有巨大潛力，酶在微生物體內(nèi)的過表達(dá)與酶的固定化技術(shù)相結(jié)合可能實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量突破。

2.3發(fā)酵與體外酶催化路線相結(jié)合

發(fā)酵法即以培養(yǎng)基組分為原料，利用微生物自身體內(nèi)代謝反應(yīng)，將低成本原料轉(zhuǎn)化為高價(jià)值產(chǎn)品，是最經(jīng)濟(jì)環(huán)保的氨基酸生產(chǎn)方式。發(fā)酵法之所以至今無法應(yīng)用于甲硫氨酸生產(chǎn)，關(guān)鍵在于其合成途徑的每一步均受到嚴(yán)格地反饋抑制，經(jīng)本課題組改造后的菌株GE37的甲硫氨酸發(fā)酵產(chǎn)量也僅為3.55g/L[20]。因此發(fā)酵法生產(chǎn)甲硫氨酸仍處于科研階段。體外酶催化反應(yīng)目前并沒有一套完整的獨(dú)立生產(chǎn)體系，而是作為化學(xué)生產(chǎn)方法的輔助手段，2000年之前即用于DL-同型半胱氨酸向L-甲硫氨酸的合成及DL-甲硫氨酸的分離[31]。近年的研究也多屬于化學(xué)合成法的下游，目的是獲得高純度的L-甲硫氨酸。酶催化與發(fā)酵法相比，反應(yīng)過程較短，反應(yīng)體系及條件易靈活操控。因此，發(fā)酵與體外酶催化路線相結(jié)合可以回避微生物的部分反饋抑制，縮短發(fā)酵過程以得到產(chǎn)量較大的中間體，進(jìn)而以此為底物合成L-甲硫氨酸。韓國杰希公司采用的發(fā)酵/化學(xué)法聯(lián)合生產(chǎn)工藝即為兩種路線結(jié)合的實(shí)例，并于2012年宣布在東南亞建立產(chǎn)能80000噸的甲硫氨酸加工廠。該路線以葡萄糖為基質(zhì)，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酰高絲氨酸，隨后用酶將這一中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成甲硫氨酸和琥珀酸。如圖3所示，經(jīng)計(jì)算，這種全新的發(fā)酵/化學(xué)法聯(lián)合工藝生產(chǎn)的L-甲硫氨酸成本略高于化學(xué)合成法[6]。

3面臨的問題及展望

3.1發(fā)酵法生產(chǎn)面臨的問題和建議

甲硫氨酸與其他氨基酸相比至今難以實(shí)現(xiàn)發(fā)酵法生產(chǎn)，綜合上文所述，總結(jié)了以下三個(gè)方面原因和建議：

3.1.1硫源的利用效率

甲硫氨酸與其他氨基酸最大的不同即對(duì)硫源的需求，而發(fā)酵法應(yīng)用最普遍的硫源為硫酸鹽，需消耗大量NADPH，但生物體能提供的NADPH有限；硫化物對(duì)NADPH需求量雖少，但因多有毒且穩(wěn)定性差，不適用于培養(yǎng)基；硫代硫酸鹽兼具氧化性與還原性，應(yīng)該對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步選擇和研究。甲硫醇作為硫和甲基的綜合供體，可以縮短代謝途徑并為最后一步提供更多甲基。因此，應(yīng)該對(duì)硫代硫酸鹽與甲硫醇或二甲基二硫的復(fù)合使用進(jìn)行新的嘗試。提高NADPH的供應(yīng)量也是菌株改造的策略之一。

3.1.2代謝途徑調(diào)控的改造硫和甲基的參與已經(jīng)使代謝途徑增長，而合成途徑中涉及到諸多反饋抑制性酶，進(jìn)一步削弱了代謝流。如何確定關(guān)鍵酶、發(fā)現(xiàn)酶的活性中心及抑制劑結(jié)合位點(diǎn)，并進(jìn)一步識(shí)別關(guān)鍵殘基成為一個(gè)艱巨的課題。通過半理性設(shè)計(jì)，本課題組已找出北京棒桿菌(Corynebacteriumpekinense)天冬氨酸激酶與抑制劑結(jié)合位點(diǎn)有直接或間接作用的所有關(guān)鍵氨基酸殘基，并通過突變解除反饋抑制得到高活力菌株。2013年，李慧穎[32]得到突變體R169H，酶活較突變前提高2.3倍；同年，郭永玲[33]得到突變體T361N、A362I，酶活分別提高47.99倍、34.60倍；2014年，任軍等[34]得到突變體G277K，酶活提高9.48倍；同年，朱運(yùn)明等[35]得到突變體G377F，酶活提高9.3倍。此外，類似的單基因修飾研究缺少全面性和持續(xù)性，還應(yīng)對(duì)改造前后的代謝流變化進(jìn)行對(duì)比分析，嘗試針對(duì)改造后的缺陷進(jìn)行多基因修飾，繼續(xù)對(duì)甲硫氨酸產(chǎn)量是否提高進(jìn)行試驗(yàn)。較成功的理性設(shè)計(jì)在甲硫氨酸同族氨基酸——賴氨酸生產(chǎn)中有成功的先例。2013年，SKind等人[36]根據(jù)TCA循環(huán)和賴氨酸合成途徑相關(guān)知識(shí)，通過敲除sucCD在琥珀酰輔酶A合成酶水平上有目的性地阻斷TCA循環(huán)，使其與賴氨酸合成途徑相結(jié)合，增加目的產(chǎn)物合成途徑代謝流，產(chǎn)量提高60%。由于理性設(shè)計(jì)需要大量全面準(zhǔn)確的生物學(xué)信息，直接針對(duì)代謝流的整合在甲硫氨酸研究領(lǐng)域還需要嘗試和突破。

3.1.3關(guān)鍵酶在代謝過程中的穩(wěn)定性

在大腸桿菌和根癌土壤桿菌中均證實(shí)了高絲氨酸?；D(zhuǎn)移酶(homoserinetranssuccinylase,HTS)的不穩(wěn)定性，這可能也是賴氨酸和蘇氨酸易發(fā)酵生產(chǎn)，而同一途徑下游的甲硫氨酸卻一直難以實(shí)現(xiàn)發(fā)酵生產(chǎn)的重要原因。其極端不耐熱和易被蛋白酶分解這兩大特性，是發(fā)酵法面臨的難題。對(duì)Biran等人發(fā)現(xiàn)的四種可能分解HTS的蛋白酶進(jìn)行修飾，或與嗜熱菌關(guān)鍵基因整合都是菌株改造可以嘗試的方向。此外，甲硫氨酸向胞外輸出的研究尚不成熟，可在菌株改造后，對(duì)胞內(nèi)組分進(jìn)行量化分析，以探索胞內(nèi)甲硫氨酸產(chǎn)量最大時(shí)的條件，以及能分泌到胞外營養(yǎng)缺陷型菌種選育。

3.2酶法生產(chǎn)面臨的問題和建議

篇3

關(guān)鍵詞：肽類毒素　脂多糖內(nèi)毒素　霉菌毒素　檢測方法

項(xiàng)目類別：農(nóng)業(yè)科技 項(xiàng)目編號(hào)：XF11C004 項(xiàng)目名稱：徐州市乳品質(zhì)量安全檢測技術(shù)

生物毒素主要指微生物在生長代謝過程中產(chǎn)生的有毒化學(xué)物質(zhì)，微量毒素侵入機(jī)體后即可引起生物機(jī)能破壞，使人畜中毒。包括肽類毒素、脂多糖內(nèi)毒素、霉菌毒素等。

肽類毒素主要有溶血素、腸毒素等，其中產(chǎn)生溶血素的細(xì)菌主要有單核細(xì)胞增生李斯特菌、霍亂弧菌等。溶血素的致病機(jī)理是作用于細(xì)胞膜，造成其結(jié)構(gòu)和功能的紊亂，使大量細(xì)胞內(nèi)的成分泄漏，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。產(chǎn)生腸毒素的細(xì)菌主要有金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌等。腸毒素是細(xì)菌外毒素，通過吸收或在腸內(nèi)產(chǎn)生，作用于腸黏膜，通常引起腹瀉等不適癥狀。

脂多糖內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要組成成分。研究表明，過量的脂多糖內(nèi)毒素可引起機(jī)體嚴(yán)重的病理生理反應(yīng)，表現(xiàn)為發(fā)熱、低血壓、休克、器官功能衰竭甚至死亡等。

霉菌毒素是霉菌產(chǎn)生的一種有毒的次級(jí)代謝產(chǎn)物，它是主要的真菌毒素，多數(shù)具有致癌作用。霉菌毒素主要有：黃曲霉素、赭曲霉素、單端孢霉烯族毒素等。目前為止，黃曲霉毒素有　B　1、B　2、M　1、M　2、G　1、G2　等幾種，其中黃曲霉素B1的毒性和致癌性最強(qiáng)，被稱為第一大類致癌物。赭曲霉素有　A、B、C、D　共4　種，其中毒性最大的是赭曲霉素A。單端孢霉烯族毒素中比較常見的是A　類單端孢霉烯族毒素，它主要包括T-2　毒素和HT-2　毒素。

目前，生物毒素的檢測技術(shù)已得到越來越多的重視，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)這些毒素也研究頗多。傳統(tǒng)的檢測技術(shù)以檢測致病菌為主，需要培養(yǎng)，檢測時(shí)間長?，F(xiàn)代檢測技術(shù)簡便、快速、靈敏度高，且能達(dá)到微量檢測的目的。本文對(duì)這些生物毒素的檢測技術(shù)進(jìn)行較為詳細(xì)的闡述并對(duì)這些方法的特點(diǎn)進(jìn)行總結(jié)。

1、肽類毒素的檢測

肽類毒素傳統(tǒng)的檢測方法主要有：酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)和生物傳感技術(shù)等。近年來產(chǎn)生了一些新興檢測技術(shù)，如：懸浮芯片技術(shù)等。

1.1　酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)

酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)是利用酶標(biāo)記物同抗原抗體復(fù)合物的免疫反應(yīng)與酶的催化放大作用相結(jié)合，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原或抗體反應(yīng)和酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。所生成的顏色深淺與待測標(biāo)本含量成比例，由此進(jìn)行定性或定量分析。酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)是一種敏感、快速、簡單的方法，應(yīng)用較廣，但是利用酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)檢測食品中金黃色葡萄球菌腸毒素時(shí)，會(huì)因?yàn)榧訇栃曰蚣訇幮杂绊憴z測結(jié)果。

1.2　聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)

聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)是一種在體外模擬DNA　復(fù)制過程，對(duì)特定的DNA或DN段進(jìn)行快速擴(kuò)增的方法。聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)具有靈敏度高、檢測時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。目前常用的聚合酶鏈反應(yīng)種類有定性聚合酶鏈反應(yīng)和熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)是把熒光基團(tuán)加入普通聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)反應(yīng)體系中，利用熒光信號(hào)積累檢測整個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)反應(yīng)的進(jìn)程，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知物進(jìn)行定量。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)比常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)自動(dòng)化程度更高、特異性更強(qiáng)，其應(yīng)用也更廣泛。根據(jù)報(bào)道已有包括葡萄球菌各型腸毒素，大腸桿菌毒素等30多種毒素可以應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)來檢驗(yàn)。

1.3　生物傳感技術(shù)

生物傳感技術(shù)是以酶的催化或者抗原抗體結(jié)合等特異反應(yīng)，通過換能器將反應(yīng)結(jié)果輸出為可檢測的信號(hào)通過信號(hào)分析定性或定量待測物質(zhì)。生物傳感器檢測法具有分析速度快、檢樣微量、生物功能膜可反復(fù)多次使用等特點(diǎn)，可用于許多物質(zhì)的檢測。

1.4　懸浮芯片技術(shù)

懸浮芯片技術(shù)具有操作簡便、重復(fù)性好、靈敏度高以及線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。國外已經(jīng)有利用懸浮芯片技術(shù)檢測的報(bào)道。國內(nèi)孫肖紅等利用懸浮芯片系統(tǒng)建立檢測模型，檢測不同濃度金黃色葡萄球菌腸毒素B，其線性范圍為0.2～1653.4ng/mL，最低檢測值為203pg/mL均優(yōu)于酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)（最低檢測質(zhì)量濃度為60ng/mL），除與2.μg/mL金黃色葡萄球菌熱休克毒素有交叉反應(yīng)外，和其他幾種細(xì)菌、毒素、蛋白均無交叉反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)證明懸浮芯片定量檢測方法對(duì)于模擬添加的金黃色葡萄球菌腸毒素B　具有良好的檢測效果。這比國外報(bào)道的熒光免疫層析法、磁免疫層析法、芯片傳感器等方法的靈敏度都要高，與生物傳感器-　質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、毛細(xì)管芯片技術(shù)等在同一數(shù)量級(jí)。綜合國內(nèi)外對(duì)懸浮芯片的研究來看，該技術(shù)應(yīng)用前景十分廣闊，但是懸浮芯片能否從粉末樣品中直接檢測毒素和病原，尚缺乏模型和評(píng)價(jià)。

2、脂多糖內(nèi)毒素的檢測

1968年，國外研究人員Levin等建立了利用鱟實(shí)驗(yàn)檢測脂多糖內(nèi)毒素的方法。近幾十年來，脂多糖內(nèi)毒素的檢測方法已有很大進(jìn)展，實(shí)驗(yàn)簡便、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確性高，但是由于費(fèi)時(shí)、響應(yīng)慢、自動(dòng)化程度低等原因已限制了其應(yīng)用。近十年來出現(xiàn)了利用生物傳感技術(shù)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測細(xì)菌內(nèi)毒素的報(bào)道。國外研究人員Goh等用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白固定在傳感器上制成了熒光內(nèi)毒素生物傳感器，根據(jù)脂多糖內(nèi)毒素與之結(jié)合時(shí)熒光強(qiáng)度的衰減檢測細(xì)菌內(nèi)毒素的含量。此熒光生物傳感器存在非分析物產(chǎn)生的熒光干擾問題，是近年來發(fā)展較快的一類光學(xué)生物傳感器。國內(nèi)岳麗娜等利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀聯(lián)用技術(shù)，對(duì)脂多糖內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品所含的3-羥基脂肪酸種類進(jìn)行檢測，用于分析脂多糖內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品菌種來源的純度。結(jié)果表明脂多糖內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品中含有非腸道細(xì)菌，因此會(huì)出現(xiàn)誤差，對(duì)檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀聯(lián)用法檢測脂多糖內(nèi)毒素，不受其標(biāo)準(zhǔn)品及細(xì)菌的生物活性的限制，可用于細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品菌株來源的輔助監(jiān)控及應(yīng)用中的異常情況的研究分析。

此外，檢測脂多糖內(nèi)毒素也有酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、化學(xué)發(fā)光測定法等方法，這些方法特異性、準(zhǔn)確性高，但需要專業(yè)人員操作，步驟多，必須在實(shí)驗(yàn)室完成，其應(yīng)用需要大量實(shí)際操作驗(yàn)證。

3、霉菌毒素的檢測

檢測霉菌霉素的常規(guī)方法由經(jīng)典的薄層色譜法發(fā)展到高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)、免疫親和層析法等?，F(xiàn)在，質(zhì)譜分析已被引入毒素分析中并衍生出各種質(zhì)譜方法，如高效液相色譜法-常壓化學(xué)電離質(zhì)譜測定法、液質(zhì)連用法、電噴霧-質(zhì)譜法、液相串聯(lián)質(zhì)譜法、超高壓液相聯(lián)合三重四極桿質(zhì)譜儀法，及同時(shí)測定上百種樣品的高效液相色譜法-串聯(lián)質(zhì)譜-電噴霧陽離子等技術(shù)。隨著這些新方法、新手段的發(fā)展，為霉菌毒素的檢測提供了比較廣的選擇，適應(yīng)了不同的檢測目的和要求。

3.1　薄層色譜法

薄層色譜法是測定食品中霉菌毒素的經(jīng)典方法，該方法操作簡便、費(fèi)用低、能同時(shí)定性定量霉菌毒素。其檢測過程是：提取、柱層析、洗脫、濃縮、薄層分離。由于此方法操作繁瑣、靈敏度低，現(xiàn)在的研究重點(diǎn)是改進(jìn)樣品的提取和凈化方法，因此建立了薄層掃描法來測定霉菌毒素，進(jìn)而提高薄層色譜法的精度。國內(nèi)張寰等報(bào)道了利用薄層掃描法，在掃描儀上繪制黃曲霉毒素掃描圖譜，并由此分辨出黃曲霉素種類，然后定量分析，從而得到樣品的黃曲霉毒素含量。鑒于此方法的靈敏度低、安全性差等缺點(diǎn)，已越來越不適用現(xiàn)代分析的要求。

3.2　高效液相色譜法

高效液相色譜法具有高效、快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好、檢測限低、定量準(zhǔn)確的特點(diǎn)，是定性定量霉菌毒素的常用方法，其中應(yīng)用最廣的是反相高效液相色譜法。國外研究人員Sobolev等利用高效液相色譜法，以新研發(fā)的氧化物質(zhì)Al2O3作為流動(dòng)相，對(duì)農(nóng)產(chǎn)品的甲醇　―　水提取液進(jìn)行凈化處理，樣品中加標(biāo)品2.5～7.5ng/g，結(jié)果表明：AFBl、AFB2、AFGl、AFG2　的回收率為　80%～87%，最低檢測限為1.0ng/g，此方法與商業(yè)檢測黃曲霉素方法相比，凈化設(shè)備費(fèi)用更低。國外研究人員Razzazi-Fazeli等利用高效液相色譜法-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測單端孢霉烯族毒素，檢測限為　5　0～8　5　n　g　/　g，回收率為77%～101%。鑒于高效液相色譜法的這些優(yōu)點(diǎn)，其在霉菌毒素檢測中的應(yīng)用越來越多，但是由于樣品前處理較復(fù)雜，設(shè)備昂貴，操作時(shí)需專門人員等問題，難以滿足快速檢測的目的，限制了其應(yīng)用。

3.3　酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)

酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)法靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便，適宜大量樣品的快速篩選，且設(shè)備費(fèi)用比高效液相色譜法低，因此廣泛用于霉菌毒素的檢測。利用此方法檢測霉菌毒素可以達(dá)到定性定量的目的。此外，根據(jù)酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)開發(fā)的毒素試劑盒實(shí)現(xiàn)了快速檢測霉菌毒素的目的。國外Saha等利用基于酶聯(lián)免疫檢測的流動(dòng)裝置檢測紅辣椒中黃曲霉素B1與赭曲霉毒素A，檢測限分別為2ng/g　和10ng/g，結(jié)果證明此方法準(zhǔn)確性高，與單獨(dú)酶聯(lián)免疫檢測相關(guān)性良好，并且為歐盟的法定標(biāo)準(zhǔn)提供了簡單、快速、有效的檢測方法。酶聯(lián)免疫檢測測定結(jié)果易出現(xiàn)假陽性問題，且只能測定單一毒素。目前的一項(xiàng)研究是將酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)和膠體金技術(shù)與噬菌體展示技術(shù)相結(jié)合，此方法可以顯著提高檢測限，縮短檢測時(shí)間，同時(shí)可以減少毒素測定中所使用的毒素標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)實(shí)驗(yàn)人員及環(huán)境的危害，這種結(jié)合技術(shù)應(yīng)用前景廣闊[　31]。

3.4　免疫親和柱法

免疫親和柱是以單克隆免疫親和柱為分離手段，根據(jù)單克隆抗體與載體蛋白偶聯(lián)后將其填柱形成免疫親和柱，并與霉菌毒素抗原產(chǎn)生一一對(duì)應(yīng)的特異性吸附關(guān)系。免疫親和柱法包括免疫親和柱-熒光光度法和免疫親和柱-高效液相色譜法。裴道國等采用改良型免疫親和柱凈化-　熒光光度檢測技術(shù)檢測花生及花生制品中的黃曲霉毒素。結(jié)果表明：改良后的方法具有更好的準(zhǔn)確性和精密度，檢測技術(shù)操作更簡便，檢測時(shí)間由傳統(tǒng)的25min縮短至10min，大大提高了檢測效率。免疫親和柱-高效液相色譜法用于檢測霉菌毒素在國內(nèi)外的報(bào)道中也比較多。陳新等利用免疫親和柱-高效液相色譜法分別定量地檢測飼料中的黃曲霉毒素B1、B2、G1　和G2，在黃曲霉毒素B1為0～50μg/kg　測定范圍內(nèi)其線性相關(guān)系數(shù)為0.91，檢測靈敏度為1μg/kg，可以作為測定飼料及飼料原料中的黃曲霉毒素B1的定量確認(rèn)法。國外研究人員Aksenov等利用免疫親和柱-熒光-高效液相色譜法檢測了赭曲霉素，將檢測限提高至0.5mg/kg，優(yōu)化了其檢測方法。免疫親和柱法簡便快速、靈敏度極高，一個(gè)樣品只需10～15min，比傳統(tǒng)方法快。特別是免疫親和柱-高效液相色譜法可以特效性地將霉菌毒素或其他真菌毒素分離出來，分離效率和回收率高，比高效液相色譜法更有優(yōu)勢和應(yīng)用前景。

4、結(jié)論

生物毒素的檢測方法多種多樣，但其靈敏度、精度、適用條件各不相同。近幾年來，檢測肽類毒素切實(shí)可用的檢測方法主要是熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)和酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)，生物傳感器技術(shù)因其分析速度快、檢樣微量等特點(diǎn)，可用于許多物質(zhì)的檢測，但在國內(nèi)的使用情況來看，由于成本高而不能被廣泛采用。懸浮芯片技術(shù)由于操作簡便、靈敏度高以及線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，未來的應(yīng)用前景將十分廣闊。利用氣色譜法-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測脂多糖內(nèi)毒素的技術(shù)相對(duì)比較成熟，而免疫學(xué)方法在我國還處于理論階段，未來還需要大量的實(shí)踐驗(yàn)證及優(yōu)化。檢測霉菌毒素較常用的檢測方法是酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)法和免疫親和柱法。酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)法法操作簡便，成本比較低，適合大量樣品的快速篩選，且設(shè)備費(fèi)用較低，因此在我國已廣泛應(yīng)用。免疫親和柱法快速簡便、靈敏度極高，分離效率和回收率高。另外，國外一些新技術(shù)的發(fā)現(xiàn)和使用，在我國是值得引進(jìn)且具有推廣價(jià)值的。

參考文獻(xiàn)

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[4]孫肖紅，　王靜，　姜永強(qiáng)，　等.　建立金黃色葡萄球菌腸毒素B懸浮芯片定量檢測方法[J].　中國食品衛(wèi)生雜志，　2009，　12（6）：　485-488。

篇4

摘 要：隨著國民經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，各行業(yè)排放的工業(yè)廢水的量也與日俱增。其中，對(duì)水環(huán)境污染尤為嚴(yán)重當(dāng)屬造紙工業(yè)了。統(tǒng)計(jì)顯示，我國現(xiàn)有的10000多家大中小型的造紙企業(yè)，就能到達(dá)40多億t的年廢水量，是全國廢水排放總量的十分之一。廢水對(duì)生態(tài)環(huán)境造成了一定的影響。該文綜合闡述了目前造紙廢水生物治理中好氧技術(shù)、厭氧-好氧組合處理技術(shù)以及厭氧技術(shù)的應(yīng)用和進(jìn)展；對(duì)國內(nèi)外生物處理造紙廢水技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)和分析，包括應(yīng)用白腐真菌降解造紙廢水、生物酶技術(shù)和生物固定化技術(shù)。

關(guān)鍵詞：造紙廢水 好氧 厭氧 白腐真菌 生物酶 生物固定化

中圖分類號(hào)：X793 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-3791（2015）04（a）-0000-00

隨著國民經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，各行業(yè)工業(yè)廢水的排放量也在逐漸增加。其中，造紙工業(yè)排放的廢水對(duì)水環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國10000多家的大中小型造紙企業(yè)，每年就會(huì)排出40多億t的污水，占到了全國廢水排放總量的十分之一[1]。2010年，造紙廢水CODCr排放95.2萬t約占輕工行業(yè)CODCr排放總量47%[2]，對(duì)生態(tài)環(huán)境造成難以想象的破壞后果。對(duì)此，對(duì)新型的有效治理造紙廢水污染的方法以及途徑進(jìn)行探索和研究，是非常具有研究意義和現(xiàn)實(shí)意義的。

1 造紙廢水的來源和特點(diǎn)

其生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)都會(huì)產(chǎn)生廢水，但主要來自于中段水、紙機(jī)白水以及蒸煮液[3]。提取黑液后漿料在洗滌、篩選、漂白的過程中排出來的廢水，就是中段水，這種廢水成分復(fù)雜，且富含對(duì)環(huán)境危害較大的有機(jī)氯化物。紙機(jī)白水中主要有細(xì)小纖維、填料和膠料（松香等）。酸法制漿的紅液或堿法制漿的黑液叫蒸煮液，在整個(gè)造紙工業(yè)污染中占90%。堿法制漿是我國造紙業(yè)普遍采用的，其主要成分是纖維素、木質(zhì)素、半纖維素、單糖、有機(jī)酸和碳水化合物的降解產(chǎn)物等。

2.造紙廢水生物處理技術(shù)

化學(xué)方法、物理方法、生物法、物化方法等，是目前國內(nèi)外造紙污水處理的主要方法。近幾年，得到人們重視的膜分離、超臨界分離、磁分離、超聲波分離等物化處理法因比較昂貴，處理效率不高，應(yīng)用比較有限。而操作方便、運(yùn)行費(fèi)用相對(duì)較低、沒有二次污染等優(yōu)點(diǎn)的生物處理法，則越來越受重視。

2.1好氧處理技術(shù)

指借助于好氧或兼性厭氧微生物在有溶解氧的情況下來分解、吸收有機(jī)物，使之被氧化成簡單的無機(jī)物，污水得到凈化。當(dāng)前，活性污泥法和生物膜法等好氧生物法是國內(nèi)外用來處理造紙廢水的方法。

處理效果較好且成本低的活性污泥法既能去除部分色度，還能分解大量有機(jī)物質(zhì)，易于管理是我國最常用的好氧處理方法。崔延瑞等[4]采用序批式活性污泥法處理堿法草漿造紙廢水，COD的去除率高達(dá)80%。張述林[5]等采用混凝與低氧―好氧兩段活性污泥法來處理某造紙廠COD為6230mg/L的綜合廢水，可達(dá)93.8%的COD去除率。

生物膜法是指微生物附著在介質(zhì)表面上形成生物膜，且在不斷繁殖生長的同時(shí)，還能對(duì)污水中的有機(jī)污染物進(jìn)行降解吸收，將其轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的無機(jī)物和原生質(zhì)，從而達(dá)到凈化污水的作用。此方法剩余污泥量少且不會(huì)產(chǎn)生污泥膨脹，占地少，運(yùn)行管理方便。Chandler等[6]通過塑料填料，利用兩級(jí)生物膜反應(yīng)器中試處理造紙廠廢水。結(jié)果顯示，水力有3h的停留時(shí)間，可減少93%的BOD5，出水BOD5達(dá)到7.83mg/L的平均濃度。張苗等[7]采用混凝沉淀協(xié)同好氧生物膜技術(shù)深度處理造紙廢水，結(jié)果顯示，效果最為顯著的就是以FeCl3為混凝劑的協(xié)同好氧生物膜技術(shù)，最高可達(dá)69.30%的色度去除率，比單獨(dú)的混凝沉淀高了3.72 %的去除率。

2.2厭氧處理技術(shù)

在專性與兼性厭氧菌的條件下，通過發(fā)酵和分解對(duì)有機(jī)物進(jìn)行降解的處理技術(shù)稱為厭氧處理技術(shù)。與好氧處理技術(shù)相比，其污泥產(chǎn)量小、節(jié)省動(dòng)力能耗、對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)需求不高，且能更好地降解某些難降解有機(jī)物。殷承啟等[8]采用上流式厭氧污泥床（ UASB）處理二次纖維造紙廢水。UASB 穩(wěn)定運(yùn)行時(shí)對(duì)COD的去除率可達(dá)90%以上，總硬度在50%以上以及硫酸根離子80% 以上。劉峰等[9]研究了預(yù)酸析―多孔高分子載體固定化微生物厭氧流化床（AFB）處理堿法草漿黑液的效能，結(jié)果證明，AFB對(duì)黑液進(jìn)行直接處理時(shí)，發(fā)揮了其活性生物量濃度大、傳質(zhì)能力強(qiáng)的特點(diǎn)，可有效地去除COD，色度亦有所下降。采用酸析預(yù)處理利用AFB的厭氧消化功能，可去除黑液中大部分難生化降解的高分子物質(zhì)。

2.3 厭氧-好氧處理技術(shù)

造紙廢水因難降解有機(jī)物成分多、污染物濃度高、廢水流量和負(fù)荷波動(dòng)大、有較差的可生化性能等，用好氧處理效果不好且能耗大。因此，利用厭氧-好氧組合處理工藝進(jìn)行處理。首先，能使厭氧處理技術(shù)的優(yōu)勢充分發(fā)揮，水解、酸化廢水中生化性很差的高分子物質(zhì)，成為易于進(jìn)行好氧處理的較小分子或分子結(jié)構(gòu)。同時(shí)，也可對(duì)回流到厭氧池的好氧階段污泥進(jìn)行較為徹底的厭氧消化，減少整個(gè)系統(tǒng)的污泥排放。該工藝結(jié)合了厭氧與好氧處理技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，具有占地面積少、處理效果好、能耗低、節(jié)省藥劑以及運(yùn)轉(zhuǎn)、管理方便等優(yōu)點(diǎn)。

丁志芬[10]對(duì)某造紙廠應(yīng)用厭氧-好氧組合技術(shù)處理廢水的情況進(jìn)行了介紹，且和好氧工藝作了比較。結(jié)果證明，厭氧-氧工藝運(yùn)行電費(fèi)可降低50%，且運(yùn)行穩(wěn)定，其COD有機(jī)物85%都轉(zhuǎn)化為甲烷氣體了，剩余污泥量也減少了60%以上。李巡案等[11]分析了萬隆造紙廠廢水處理工程改建為厭氧-好氧工藝以及實(shí)行清潔生產(chǎn)后，污染物質(zhì)排放總量明顯減少，水質(zhì)可達(dá)到GB18918- 2002一級(jí)A標(biāo)準(zhǔn)，與原有的好氧生物處理工藝相比可節(jié)省動(dòng)力約55%。

3 生物處理造紙廢水技術(shù)的研究進(jìn)展

3.1 應(yīng)用白腐真菌對(duì)造紙廢水進(jìn)行降解

造紙工業(yè)排放黑液COD和色度形成主要是因?yàn)槟举|(zhì)素，其異質(zhì)多晶三維多聚體結(jié)構(gòu)是由甲氧基取代的對(duì)-羥基肉桂酸聚合而成，分子間的醚鍵、C-C鍵很穩(wěn)定，是當(dāng)前公認(rèn)的微生物難降解芳香化合物之一[12]。目前，國內(nèi)大部分工廠處理造紙廢水采用傳統(tǒng)生物法應(yīng)用的微生物主要以細(xì)菌為主，并不能有效去除造紙廢水中的木素衍生物以及漂白過程中產(chǎn)生的氯酚類物質(zhì)，這便成為造紙廢水達(dá)標(biāo)排放的主要障礙。

白腐真菌是目前所發(fā)現(xiàn)的對(duì)木質(zhì)素及其衍生物降解最有效的微生物。多數(shù)白腐真菌屬于擔(dān)子菌綱，少數(shù)為子囊菌綱。其中，黃飽原毛平革菌（Phanerochaete Chrysosporium）是已被廣泛研究的典型白腐真菌。

3.1.1 白腐真菌的降解機(jī)制及優(yōu)勢

白腐菌降解木質(zhì)素通常分兩步進(jìn)行[13]：第一，菌體利用菌絲吸附木質(zhì)素；第二，白腐菌分泌出的酶催化氧化木質(zhì)素等污染物，主要分為細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外兩過程，整個(gè)降解系統(tǒng)在主要營養(yǎng)物質(zhì)（ 碳、氮、硫） 限制條件下才得以啟動(dòng)形成[14～16]。錳過氧化物酶（ Mnp）、漆酶（La）、木質(zhì)素過氧化物酶（ Lip） 均合成于細(xì)胞內(nèi)，通過分泌到細(xì)胞外對(duì)污染物進(jìn)行降解。前兩者均須以H2O2為底物，漆酶以氧氣作電子受體催化形成醌及自由基。故降解污染物時(shí)，白腐菌需借助H2O2激活，由酶觸發(fā)啟動(dòng)自由基鏈反應(yīng)，產(chǎn)生具有超常的氧化能力的細(xì)胞外?OH，對(duì)芳香化合物有很好的降解作用。

故白腐菌在降解污染物上所有具有的優(yōu)點(diǎn)是其他生物系統(tǒng)尤其是細(xì)菌沒有的[14]：（1）特定污染物不需要預(yù)條件化：處理系統(tǒng)以細(xì)菌為主的，誘導(dǎo)合成所需的降解酶須預(yù)先置于一定有效濃度的污染物。白腐真菌降解酶的誘導(dǎo)與降解底物的有無多少無關(guān)。（2）動(dòng)力學(xué)優(yōu)勢：細(xì)菌對(duì)化學(xué)物的降解多為酶促轉(zhuǎn)化，遵循米氏動(dòng)力學(xué)。初始氧化反應(yīng)的酶經(jīng)白腐真菌催化啟動(dòng)對(duì)底物沒有真正意義上的Km值，對(duì)氧化產(chǎn)物的形成有利。（3）產(chǎn)生氧化能力極強(qiáng)的?OH （4）有毒污染物不必進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)代謝而在其細(xì)胞外即可有效降解。可忍受高濃度有毒污染物的同時(shí)，避免有毒污染物對(duì)細(xì)胞的毒害。（5）非專一性降解的特性：能降解大量結(jié)構(gòu)不同的化學(xué)物質(zhì)。（6）對(duì)營養(yǎng)物的要求低。

3.1.2 白腐菌在造紙廢水中的應(yīng)用

從上述可知白腐真菌在治理造紙廢水方面有極大的研究價(jià)值。吳涓等[17]比較了幾株白腐真菌在造紙黑液廢水中的掛膜生長狀況及其對(duì)黑液廢水的處理效果。黃孢原毛平革菌、側(cè)耳菌和S22菌都可以在較強(qiáng)堿性的廢水中生長掛膜，且對(duì)木質(zhì)素有顯著的降解作用，有很強(qiáng)的適應(yīng)廢水的能力。李雪芝等[18]用8株不同的白腐菌對(duì)造紙廢水進(jìn)行處理，選出的白腐菌L02處理效果是最好的。該菌株可直接應(yīng)用于造紙廢水的處理，大幅度降低廢水CODCr含量（降低84%以上）、廢水的色度（降低93%以上）以及廢水的pH值。路忻[19]采用序列間歇式活性污泥法（SBR）法利用白腐菌共代謝理論分析及處理試驗(yàn)研究含木質(zhì)素的造紙廢水。結(jié)果表明，相同進(jìn)水COD濃度和水力停留時(shí)間，與單純好氧生物處理相比，共代謝作用下好氧處理的COD去除率要高得多，有約30%的提高率。

3.2 生物酶技術(shù)

白腐菌降解木質(zhì)素，是通過其分泌的酶的作用來實(shí)現(xiàn)。相較于錳過氧化物酶、木質(zhì)素過氧化酶，在白腐菌木質(zhì)素降解酶系統(tǒng)中，漆酶的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值更大一些。首先，木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶產(chǎn)生的條件是限碳和氮的。而漆酶可在碳和/或氮存在條件下由菌體分泌[20]。其次，木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶只在系統(tǒng)存在H2O2時(shí)，才可降解有機(jī)污染物，這在現(xiàn)實(shí)情況下很難實(shí)現(xiàn)的。最后，重要的還在于漆酶具有780 mV氧化還原電位，在不存在H2O2和其它次級(jí)代謝產(chǎn)物時(shí)，有機(jī)污染物的氧化也能夠被催化。所以，在環(huán)境保護(hù)和生物技術(shù)方面，漆酶的應(yīng)用潛力是非常巨大的。

據(jù)林鹿等人[21]研究通過漆酶進(jìn)行去除桉木硫酸鹽漿CEH漂白廢水時(shí)發(fā)現(xiàn)，它可以把廢水中有毒物質(zhì)去除掉40%以上。造紙廢液中有機(jī)氯化物用漆酶處理，具有高效能的催化作用，反應(yīng)條件溫和，對(duì)反應(yīng)設(shè)備和反應(yīng)條件要求也不高。謝益民等[22]采用雜色云芝發(fā)酵產(chǎn)生的漆酶液深度處理造紙廠二沉池出水，結(jié)果表明，經(jīng)催化氧化作用，漆酶及其介體體系可氧化聚合廢水中的大部分殘余木素。在最佳實(shí)驗(yàn)處理?xiàng)l件下，木素、CODCr和色度的去除率分別達(dá)到82. 0%、76. 9% 和84. 9%。同時(shí)，紙漿生物漂白上的研究熱點(diǎn)也包括漆酶。通過酶法漂白紙漿，脫氯效果更好[23]，相對(duì)于傳統(tǒng)的氯氣漂白法所產(chǎn)生的有毒的氯酚類化合物而言，其避免了對(duì)環(huán)境的污染。

3.3 生物固定化技術(shù)

微生物固定化技術(shù)是通過化學(xué)或物理的方法，把游離酶或細(xì)胞限定在一定的空間區(qū)域內(nèi)，使其能反復(fù)利用且保持活性，利于除去高濃度有機(jī)物或某些難降解物質(zhì)。Messner等[24]利用生物滴濾器原理而開發(fā)的MYCOPOR反應(yīng)器，在多孔的載體填料上把白腐菌固定好，廢水由從頂部到載體的這個(gè)過程就能夠得到凈化了。處理6～12h，87%、80%和40%的色度、AOX和COD可去除。李朝霞等[25]采用一種新型海藻酸鈉/殼聚糖/活性炭生物微膠囊固定化白腐菌和懸浮態(tài)白腐菌，在不同接種量下降解造紙廢水。結(jié)果顯示，白腐菌在不同的兩種狀態(tài)下均能對(duì)造紙廢水進(jìn)行降解，不過在代謝穩(wěn)定性和降解木質(zhì)素能力等方面，固定化白腐菌比懸浮態(tài)白腐菌明顯要強(qiáng)。劉帥等[26] 用固定漆酶和游離漆酶對(duì)造紙廢水進(jìn)行深度處理。通過對(duì)廢水處理的效果對(duì)比，固定漆酶的優(yōu)點(diǎn)在于達(dá)到最佳效果的反應(yīng)時(shí)間短， 酶的穩(wěn)定性高， 溫度耐受性強(qiáng)，pH適應(yīng)性顯著增強(qiáng)。

4 結(jié)語

作為一種處理難、成分復(fù)雜的工業(yè)廢水，通過傳統(tǒng)的處理技術(shù)造紙廢水已很難滿足如今的排放要求。因此，要實(shí)現(xiàn)極大減少造紙廢水的排放或者實(shí)現(xiàn)零排放，需大力發(fā)展微生物處理技術(shù)。使微生物與處理技術(shù)相結(jié)合，為造紙業(yè)的綠色發(fā)展鋪平道路。

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篇5

關(guān)鍵詞：生物質(zhì)；燃料；液化；進(jìn)展；

中圖分類號(hào)：TK6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-3520（2015）-01-00-02

液體燃料的不足已嚴(yán)重威脅到我國的能源與經(jīng)濟(jì)安全。我國一次能源消費(fèi)量僅次于美國成為世界第二大能源消費(fèi)國， 2006年進(jìn)口原油已達(dá)5000萬t，占總量40%。因此，國家提出了大力開發(fā)新能源和可再生能源，優(yōu)化能源結(jié)構(gòu)的戰(zhàn)略發(fā)展規(guī)劃[1-2]。生物質(zhì)燃料是惟一可以轉(zhuǎn)化為液體燃料的可再生能源，將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為液體燃料不僅能夠彌補(bǔ)化石燃料的不足，而且有助于保護(hù)生態(tài)環(huán)境。生物質(zhì)燃料包括各種農(nóng)業(yè)廢棄物、林業(yè)廢棄物以及各種有機(jī)垃圾等。我國生物質(zhì)資源豐富，理論年產(chǎn)量為50億t左右，發(fā)展生物質(zhì)液化替代化石燃料有巨大的資源潛力。

目前生物質(zhì)液化還處于研究、開發(fā)及示范階段。從工藝上，生物質(zhì)液化又可分為生化法和熱化學(xué)法。生化法主要是指采用水解、發(fā)酵等手段將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為燃料乙醇。熱化學(xué)法主要包括快速熱解液化和加壓催化液化等[3-8] 。本文主要介紹生物質(zhì)燃料液化制取液體燃料的技術(shù)與研究進(jìn)展。

一、生化法生產(chǎn)燃料乙醇

生物質(zhì)生產(chǎn)燃料乙醇的原料主要有能源農(nóng)作物、剩余糧食和農(nóng)作物秸稈等。美國和巴西分別用本國生產(chǎn)的玉米和甘蔗大量生產(chǎn)乙醇作為車用燃料。從1975年以來，巴西為擺脫對(duì)石油的依賴，開展了世界最大規(guī)模的燃料乙醇開發(fā)計(jì)劃，到1991年燃料乙醇產(chǎn)量已達(dá)130億L。美國自1991年以來，為維持每年50億L的玉米制乙醇產(chǎn)量，政府每年要付出7億美元的巨額補(bǔ)貼[2，3，8]。利用糧食等淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)乙醇是工藝很成熟的傳統(tǒng)技術(shù)。用糧食生產(chǎn)燃料乙醇雖然成本高，價(jià)格上對(duì)石油燃料沒有競爭力。雖然我國政府于2002年制定了以陳化糧生產(chǎn)燃料乙醇的政策，將燃料乙醇按一定比例加到汽油中作為汽車燃料，已在河南和吉林兩省示范。然而我國剩余糧食即使按大豐收時(shí)的3000萬t全部轉(zhuǎn)化為乙醇來算，可生產(chǎn)1000萬t乙醇，也只有2000年原油缺口的1/10；而且隨著中國人口的持續(xù)增長，糧食很難出現(xiàn)大量剩余。2007年以來，糧食價(jià)格高漲，給國家的安定帶來威脅，因此，在我國非糧生物質(zhì)燃料才是唯一可靠的生物質(zhì)能源。

從原料供給及社會(huì)經(jīng)濟(jì)環(huán)境效益來看，用含纖維素較高的農(nóng)林廢棄物生產(chǎn)乙醇是比較理想的工藝路線。生物質(zhì)制燃料乙醇即把木質(zhì)纖維素水解制取葡萄糖，然后將葡萄糖發(fā)酵生成燃料乙醇的技術(shù)。我國在這方面開展了許多研究工作，比如武漢理工大學(xué)開展了農(nóng)林廢棄物真菌分解-堿溶熱解-厭氧發(fā)酵工藝的研究，轉(zhuǎn)化率在70%以上[9]。中國科學(xué)院過程工程研究所在國家攻關(guān)項(xiàng)目的支持下，開展了纖維素生物酶分解固態(tài)發(fā)酵糖化乙醇的研究，為纖維素乙醇技術(shù)的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)[10]。以美國國家可再生能源實(shí)驗(yàn)室（NREL）為代表的研究者，近年來也進(jìn)行了大量的研究工作，如通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到了能發(fā)酵五碳糖的酵母菌種，開發(fā)了同時(shí)糖化發(fā)酵工藝，并建成了幾個(gè)具有一定規(guī)模的中試工廠，但由于關(guān)鍵技術(shù)未有突破，生產(chǎn)成本一直居高不下[11-13]。纖維素制乙醇技術(shù)如果能夠取得技術(shù)突破，在未來幾十年將有很好的發(fā)展前景。

二、生物質(zhì)燃料熱化學(xué)法生產(chǎn)生物質(zhì)油

生物質(zhì)燃料熱化學(xué)法生產(chǎn)生物質(zhì)油技術(shù)根據(jù)其原理主要可分為加壓液化和快速熱解液化。

（一）生物質(zhì)燃料快速熱解液化

生物質(zhì)燃料快速熱解液化是在傳統(tǒng)裂解基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種技術(shù)，相對(duì)與傳統(tǒng)裂解，它采用超高加熱速率（102-104K/s），超短產(chǎn)物停留時(shí)間（0.2-3s）及適中的裂解溫度，使生物質(zhì)中的有機(jī)高聚物分子在隔絕空氣的條件下迅速斷裂為短鏈分子，使焦炭和產(chǎn)物氣降到最低限度，從而最大限度獲得液體產(chǎn)品。這種液體產(chǎn)品被稱為生物質(zhì)油（bio-oil），為棕黑色黏性液體，熱值達(dá)20-22MJ/kg，可直接作為燃料使用，也可經(jīng)精制成為化石燃料的替代物。因此，隨著化石燃料資源的逐漸減少，生物質(zhì)快速熱解液化的研究在國際上引起了廣泛的興趣。自1980年以來，生物質(zhì)快速熱解技術(shù)取得了很大進(jìn)展，成為最有開發(fā)潛力的生物質(zhì)液化技術(shù)之一。國際能源署組織了美國、加拿大、芬蘭、意大利、瑞典、英國等國的10多個(gè)研究小組進(jìn)行了10余年的研究與開發(fā)工作，重點(diǎn)對(duì)該過程的發(fā)展?jié)摿Α⒓夹g(shù)經(jīng)濟(jì)可行性以及參與國之間的技術(shù)交流進(jìn)行了調(diào)研，認(rèn)為生物質(zhì)快速熱解技術(shù)比其他技術(shù)可獲得更多的能源和更大的效益[14]。

世界各國通過反應(yīng)器的設(shè)計(jì)、制造及工藝條件的控制，開發(fā)了各種類型的快速熱解工藝。幾種有代表性的工藝、各裝置的規(guī)模、液體產(chǎn)率等參數(shù)見文獻(xiàn) [14]。

（1）旋轉(zhuǎn)錐式反應(yīng)工藝（Twente rotating cone process），荷蘭Twente大學(xué)開發(fā)。生物質(zhì)顆粒與惰性熱載體一起加入旋轉(zhuǎn)錐底部，沿著錐壁螺旋上升過程中發(fā)生快速熱解反應(yīng)，但其最大的缺點(diǎn)是生產(chǎn)規(guī)模小，能耗較高。以德國松木粉為原料，反應(yīng)溫度600℃，進(jìn)料速率34.8kg/h的條件下，液體產(chǎn)率為58.6%。

（2）攜帶床反應(yīng)器（Entrained flow reactor），美國Georgia 工學(xué)院（GIT）開發(fā)。以丙烷和空氣按照化學(xué)計(jì)量比引入反應(yīng)管下部的燃燒區(qū)，高溫燃燒氣將生物質(zhì)快速加熱分解，當(dāng)進(jìn)料量為15kg/h，反應(yīng)溫度745℃時(shí)，可得到58%的液體產(chǎn)物，但需要大量高溫燃燒氣并產(chǎn)生大量低熱值的不凝氣是該裝置的缺點(diǎn)。

（3）循環(huán)流化床工藝（Circulating fluid bed reactor），加拿大Ensyn工程師協(xié)會(huì)開發(fā)研制。在意大利的Bastardo建成了650kg/h規(guī)模的示范裝置，在反應(yīng)溫度550℃時(shí)，以楊木粉作為原料可產(chǎn)生65%的液體產(chǎn)品。該裝置的優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備小巧，氣相停留時(shí)間短，防止熱解蒸汽的二次裂解，從而獲得較高的液體產(chǎn)率。但其主要缺點(diǎn)是需要載氣對(duì)設(shè)備內(nèi)的熱載體及生物質(zhì)進(jìn)行流化，最高液體產(chǎn)率可達(dá)75%。

（4）渦旋反應(yīng)器（Vortex reactor），美國國家可再生能源實(shí)驗(yàn)室（NREL）開發(fā)。反應(yīng)管長0.7m，管徑0.13 m，生物質(zhì)顆粒由氮?dú)饧铀俚? 200m/s，由切線進(jìn)入反應(yīng)管，在管壁產(chǎn)生一層生物油并被迅速蒸發(fā)。目前建成的最大規(guī)模的裝置為20kg/h，在管壁溫度625℃時(shí)，液體產(chǎn)率可達(dá)55%。

總之，生物質(zhì)快速裂解技術(shù)具有很高的加熱和傳熱速率，且處理量可以達(dá)到較高的規(guī)模，目前來看，該工藝取得的液體產(chǎn)率最高。熱等離子體快速熱解液化是最近出現(xiàn)的生物質(zhì)液化新方法，它采用熱等離子體加熱生物質(zhì)顆粒，使其快速升溫，然后迅速分離、冷凝，得到液體產(chǎn)物，我國的開展了這方面的試驗(yàn)研究。

（二）加壓液化

生物質(zhì)加壓液化是在較高壓力下的熱轉(zhuǎn)化過程，溫度一般低于快速熱解。最著名是PERC法。該法始于20世紀(jì)60年代，當(dāng)時(shí)美國的Appell等人將木片、木屑放入Na2CO3溶液中，用CO加壓至28MPa，使原料在350℃下反應(yīng)，結(jié)果得到40%-50%的液體產(chǎn)物。近年來，人們不斷嘗試采用H2加壓，使用溶劑及催化劑（如Co-Mo、Ni-Mo系加氫催化劑）等手段，使液體產(chǎn)率大幅度提高，甚至可以達(dá)80%以上，液體產(chǎn)物的高位熱值可達(dá)25-30MJ/kg，明顯高于快速熱解液化。超臨界液化是利用超臨界流體良好的滲透能力、溶解能力和傳遞特性而進(jìn)行的生物質(zhì)液化，最近歐美等國正積極開展這方面的研究工作[15-17]。和快速熱解液化相比，目前加壓液化還處在實(shí)驗(yàn)室階段，但由于其反應(yīng)條件相對(duì)溫和，對(duì)設(shè)備要求不很苛刻，在規(guī)?；_發(fā)上有很大潛力。

生物質(zhì)燃料轉(zhuǎn)化為液體后，能量密度大大提高，可直接作為燃料用于內(nèi)燃機(jī)，熱效率是直接燃燒的4倍以上。但是，由于生物油含氧量高（約35wt%），精煉成本較高，因而降低了生物質(zhì)裂解油與化石燃料的競爭力。這也是長期以來沒有很好解決的技術(shù)難題。

三、結(jié)論與建議

隨著化石燃料資源的逐漸減少，生物質(zhì)燃料液化技術(shù)的研究在國際上引起了廣泛的興趣。經(jīng)過近30年的研究與開發(fā)，車用燃料乙醇的生產(chǎn)已實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，快速熱解液化已達(dá)到工業(yè)示范階段，加壓液化還處于實(shí)驗(yàn)研究階段。我國生物質(zhì)資源豐富，每年可利用的資源量達(dá)50億t，僅農(nóng)作物秸稈就有7億t，但目前大部分作為廢棄物沒有合理利用，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。如果將其中的50%采用生物質(zhì)液化技術(shù)轉(zhuǎn)化為燃料乙醇和生物質(zhì)油，可以得到5億-10億t油當(dāng)量的液體燃料，基本能夠滿足我國的能源需求。因此，發(fā)展生物質(zhì)液化在我國有著廣闊的前景。

我國在生物質(zhì)快速熱解液化及加壓液化方面的研究工作還很少，與國際先進(jìn)水平有較大差距，需要加強(qiáng)此項(xiàng)研究。開發(fā)生物質(zhì)油精制與品位提升新工藝，降低生產(chǎn)成本是生物質(zhì)熱化學(xué)法液化進(jìn)一步發(fā)展，提高與化石燃料競爭力的關(guān)鍵。

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篇6

關(guān)鍵詞：生物發(fā)酵；在線檢測技術(shù)；控制技術(shù)；進(jìn)展

生物發(fā)酵技術(shù)和我們的日常生活緊密相關(guān)，生活中隨處可見發(fā)酵技術(shù)，如味精、啤酒、洗滌劑等。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，為人類利用與改造生命活動(dòng)提供了更多的新手段，為解決資源與安全、糧食安全、能源安全等問題提供了新的選擇。近年來，生化工業(yè)進(jìn)入蓬勃發(fā)展時(shí)期，這使得藥物生產(chǎn)、污水處理、酶制劑等行業(yè)也取得了較快發(fā)展，進(jìn)而又對(duì)發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生影響，如生化工程在線檢測、監(jiān)督檢測、自動(dòng)化控制等問題，是當(dāng)前發(fā)酵工程必須面臨的問題。以下主要對(duì)生物發(fā)酵過程的相關(guān)事項(xiàng)進(jìn)行分析。

1 生物發(fā)酵工程概述

生物發(fā)酵工程的概念較多，現(xiàn)代意義上關(guān)于生物發(fā)酵工程的理解為：在合適的pH酸堿度值、陽光照射度、培養(yǎng)基等條件上，利用微生物的一些特點(diǎn)，并借助一些現(xiàn)代工程技術(shù)對(duì)微生物進(jìn)行生產(chǎn)，從而培育出一些能夠滿足人類進(jìn)行生產(chǎn)活動(dòng)的物質(zhì)，或是將微生物用于現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)的一種技術(shù)體系[1]。

現(xiàn)階段，微生物發(fā)酵工程面臨的一大問題是自動(dòng)化控制問題。為了順利解決該難題，首先應(yīng)對(duì)微生物的不同特點(diǎn)有充足的了解。在科學(xué)技術(shù)快速發(fā)展的背景下，人們了解微生物的方式已經(jīng)發(fā)生了改變，已經(jīng)由原來的借助微生物形態(tài)進(jìn)行表面認(rèn)識(shí)，轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)復(fù)雜生物學(xué)與細(xì)胞調(diào)節(jié)等方面。然而，微生物細(xì)胞較復(fù)雜，這使得生物發(fā)酵工程也變成了一類重復(fù)性差、高度非線性、慢性變、復(fù)雜的生化過程。因此，在研究過程中，不可僅從表面對(duì)生物發(fā)酵過程進(jìn)行分析，而根據(jù)檢測得到的過程參數(shù)對(duì)生化發(fā)酵過程進(jìn)行詳細(xì)分析。一般來說，檢測的過程參數(shù)主要包括物理參數(shù)、生物參數(shù)與化學(xué)參數(shù)這幾類。

2 發(fā)酵過程在線檢測的重要指標(biāo)

生物發(fā)酵過程的在線檢測，往往涉及一些重要指標(biāo)，常見的主要包括以下這幾個(gè)重要指標(biāo)：溫度，可用于判斷微生物維持生長時(shí)間，多采用PT100方法測試；空氣流量，用于排泄廢氣或供氧，采用渦街流量計(jì)測試；罐壓，用于增加DO或維持正壓，使用數(shù)顯壓力表測試；pH，用于范穎細(xì)胞的代謝途徑，使用pH電極測試；體積，用于反映操作的穩(wěn)定性，使用差壓變送器測試；溶氧，用于反映供氧情況，使用溶氧電極測試[2]。

在對(duì)發(fā)酵過程進(jìn)行在線檢測時(shí)，一般是用專門的傳感器放到發(fā)酵系統(tǒng)中，然后傳遞出發(fā)酵的相關(guān)信息，為開展發(fā)酵控制工作提供有用的依據(jù)。因?yàn)槲⑸锱囵B(yǎng)過程屬于一個(gè)純培養(yǎng)的過程，要求有很好的無菌環(huán)境，故要求傳感器應(yīng)滿足以下幾種情況：（1）如果是插入罐內(nèi)的傳感器，應(yīng)具備經(jīng)受高壓蒸汽滅菌的能力；（2）具有穩(wěn)定的性能，受氣泡的影響較小；（3）結(jié)構(gòu)不可有滅菌不透的死角，以免被細(xì)菌污染；（4）在測量參數(shù)方面，應(yīng)具有較高的敏感性，且可轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。

3 生物發(fā)酵過程的在線檢測與控制技術(shù)進(jìn)展分析

微生物發(fā)酵過程屬于一種生化反應(yīng)過程，主要是為了促進(jìn)最終產(chǎn)物利用率的提升，確保微生物生長環(huán)境的舒適度。在舒適、適宜的環(huán)境中，有利于微生物進(jìn)行有效的生長代謝，并能實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物發(fā)酵過程的在線檢測與控制，從而提升微生物發(fā)酵產(chǎn)品的利用率，發(fā)揮其最大作用[3]。具體來說，主要包括以下幾個(gè)方面。

（1）電機(jī)攪拌熱、冷卻水溫度、微生物發(fā)酵熱等因素，均可能影響發(fā)酵的溫度。此外，發(fā)酵罐體積大小，也會(huì)在一定程度上影響發(fā)酵溫度的控制。如果發(fā)酵罐的體積較大，往往會(huì)采用冷卻水或發(fā)酵溫度為主回路的串級(jí)控制方式；如果是體積較小的發(fā)酵罐，多采用冷卻水流量、發(fā)酵溫度為主的簡單回路控制方式。

（2）在微生物發(fā)酵過程中，生物發(fā)酵也會(huì)受溶解氧濃度的控制情況影響。然而，現(xiàn)階段國內(nèi)對(duì)該方面的研究較少，僅限于了解到哪些因素會(huì)對(duì)溶解氧濃度產(chǎn)生影響。目前，影響溶解氧濃度的因素主要有：供給的空氣量、發(fā)酵罐本身的壓力、攪拌槳的轉(zhuǎn)速及形狀。

（3）在微生物發(fā)酵過程，pH酸堿度值也是影響在線檢測與控制的一個(gè)重要因素[4]。若pH酸堿度值過高或過低，微生物的生成及代謝過程都會(huì)發(fā)生變化，故必須保證酸堿度值得合適。若發(fā)酵液的酸堿度為強(qiáng)酸性，可通過加氧水的方法弱化其酸性；若發(fā)酵液濃度為強(qiáng)堿性，可通過加糖的方式弱化其堿性，調(diào)節(jié)發(fā)酵液的酸堿度，直至合適。

（4）消泡控制也是影響生物發(fā)酵工程的一個(gè)重要因素。發(fā)酵前，微生物的生長往往較旺盛，而此時(shí)若加滿液料，并將攪拌槳馬達(dá)最大速度啟動(dòng)，空氣通入量也加到最大，很容易導(dǎo)致發(fā)酵液上浮的現(xiàn)象，最終發(fā)生逃液現(xiàn)象。若發(fā)生該類情況，一般會(huì)采用雙位式控制方法進(jìn)行處理，可取得較好的效果。

（5）在生物發(fā)酵過程中，補(bǔ)料控制也是影響發(fā)酵的一個(gè)重要因素。在發(fā)酵的進(jìn)行狀態(tài)中，微生物生成代謝也會(huì)在半連續(xù)式發(fā)酵過程的變化情況下發(fā)生相應(yīng)的改變。所以，在這過程中，應(yīng)該連續(xù)不斷地為生物補(bǔ)充營養(yǎng)成分，保證微生物能夠按優(yōu)生物軌跡生長，才能促進(jìn)微生物代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的提升。

4 發(fā)酵過程中對(duì)參數(shù)進(jìn)行在線檢測的意義

在生物發(fā)酵過程進(jìn)行檢測與控制，最終目的是用最少的原料，獲得最大化的所需產(chǎn)物。在生物的發(fā)酵過程中，在線檢測與控制技術(shù)的水平如何，不但會(huì)對(duì)菌種的最大生產(chǎn)能力產(chǎn)生直接影響，還會(huì)對(duì)下游處理難易程度也產(chǎn)生影響，是一項(xiàng)承上啟下的技術(shù)。

不同于物理、化學(xué)反應(yīng)，生物過程反應(yīng)速度相對(duì)較慢，反應(yīng)物質(zhì)、產(chǎn)物濃度等的轉(zhuǎn)化率也不高。若要解決上述問題，工業(yè)微生物學(xué)通常是從兩個(gè)方面入手：（1）正確選育或改良菌種，提高發(fā)酵菌種的優(yōu)良性；（2）對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行合理控制，為生產(chǎn)出更好的目標(biāo)產(chǎn)物創(chuàng)造條件。從某種程度上看，通過控制與優(yōu)化發(fā)酵過程，能夠?qū)⑸镞^程較好地控制在一種優(yōu)化的操作環(huán)境或條件下，被認(rèn)為是促進(jìn)生產(chǎn)力提升的有效措施或捷徑之一，具有非常重要的意義。因此，在發(fā)酵過程中，相關(guān)人員必須重視對(duì)發(fā)酵過程的線檢測與控制，力將發(fā)酵環(huán)境或操作條件控制在一個(gè)較理想的狀態(tài)下，為進(jìn)一步提升生產(chǎn)水平提供強(qiáng)大的技術(shù)支持。

5 結(jié)束語

總而言之，生物發(fā)酵工程是一個(gè)復(fù)雜、技術(shù)要求高的反應(yīng)過程，與我們?nèi)粘Ｉ钕⑾⑾嚓P(guān)。在生物發(fā)酵過程中，會(huì)受多種因素影響，進(jìn)而影響到產(chǎn)品的質(zhì)量及使用率，無法發(fā)揮產(chǎn)品的最大作用。因此，對(duì)在生物發(fā)酵過程中，采用在線檢測與控制技術(shù)進(jìn)一步提升微生物的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量具有積極的意義。

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【關(guān)鍵詞】含油廢水；生物技術(shù)；過程；深度處理

一、生物處理技術(shù)的概況介紹與應(yīng)用實(shí)例

（一）概述

生物處理技術(shù)處理含油廢水指的是利用在微生物代謝作用下，將分散到水中的原油、有機(jī)污染物進(jìn)行降解處理，使有機(jī)污染物質(zhì)轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的無害物質(zhì)，最終完全無機(jī)化。近來較普遍應(yīng)用且相對(duì)成熟的生物處理工藝包括好氧生物處理技術(shù)和厭氧生物處理技術(shù)兩大類。顧名思義，所謂好氧生物處理技術(shù)，是指利用好氧微生物代謝作用處理含油廢水的技術(shù)，按所選材料，分為活性污泥法、SBR法、生物膜法、氧化塘法、AB處理法等形式；而厭氧生物處理技術(shù)，則是利用厭氧微生物作用進(jìn)行含油廢水處理的技術(shù)，按處理設(shè)備，分為厭氧接觸法、厭氧生物濾池、升流式厭氧污泥床（UASB）、厭氧生物轉(zhuǎn)盤等處理方法。這兩類生物處理技術(shù)在有機(jī)物負(fù)荷、污泥產(chǎn)率，能耗、營養(yǎng)物需要量、應(yīng)用范圍，對(duì)水溫適應(yīng)性、啟動(dòng)時(shí)間以及處理效果各方面作用不同，相對(duì)來說，好氧生物技術(shù)在處理效果上較厭氧處理技術(shù)好，但兩者各有其優(yōu)缺點(diǎn)，單純采用一種技術(shù)難以達(dá)到理想效果。因此，結(jié)合使用兩種處理技術(shù)進(jìn)行含有廢水處理變得較為普遍，遵照分級(jí)處理程序，先采用厭氧技術(shù)進(jìn)行初步處理，利用好氧工藝進(jìn)行處理檢驗(yàn)和再處理，以確定合理的技術(shù)過程。

（二）實(shí)例

學(xué)者對(duì)含油廢水處理技術(shù)的綜合研究表明，油田污水的處理方法很多，如物理法、化學(xué)法等，這兩種方法都能夠獲得一定的處理效果，但存在較多劣勢，前者成本高，后者由于投入了化學(xué)藥劑極易產(chǎn)生二次污染。相比之下，生物處理技術(shù)的經(jīng)濟(jì)性、適用性最強(qiáng)，對(duì)于大規(guī)模污水處理收到較好效果。在國內(nèi)許多油田得到應(yīng)用，以下對(duì)應(yīng)用該技術(shù)的油田及其廢水處理工藝作基本介紹：1.勝利油田王家崗廢水處理站，該站點(diǎn)建成投產(chǎn)于2002年，利用美國公司菌種，由油田自行設(shè)計(jì)完成占廢水總量約為70%的含油廢水處理工程。其技術(shù)處理過程為：含油廢水—接收罐—兩級(jí)大罐沉降—溶氣浮選—混合池—接觸氧化池—沉淀池—計(jì)量排放。該站經(jīng)過生物處理技術(shù)的廢水指標(biāo)滿足國家廢水排放標(biāo)準(zhǔn)。2.大港油田東二廢水處理站，該站用美國公司RBC菌種，借助容積為2700m3的接觸氧化池每天處理上萬立方的廢水。其廢水處理技術(shù)過程為：兩級(jí)沉降—過濾—隔油—接觸氧化池—緩沖池—氧化塘—排放。經(jīng)處理后的廢水符合國家要求排放標(biāo)準(zhǔn)。3.冀東油田高一聯(lián)廢水處理站；該站同樣建成并投產(chǎn)于2002年，該工程采用石油大學(xué)技術(shù)每天實(shí)際處理的廢水量約3600m3，僅小于設(shè)計(jì)處理能力400m3，其廢水處理技術(shù)過程為：兩級(jí)大罐沉降—過濾—緩沖罐—泵提升—冷卻塔—均質(zhì)池—厭氧池—中沉池—接觸氧化池—二沉池—緩沖池—提升—排放。對(duì)外排水質(zhì)的驗(yàn)收?qǐng)?bào)告平均數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，表明廢水排放符合國家標(biāo)準(zhǔn)。

二、含油廢水生物處理技術(shù)方法

隨著油田開采力度加大，采油技術(shù)也在不斷發(fā)展，前后經(jīng)歷了天然能量動(dòng)力、人工注水方式、改變注入水特性這三次采油變化。目前較普遍采用以人工注水方式保持地層壓力，以及通過改變注入水的特性提高采油率的后兩種采油方式。由于經(jīng)電脫水、分離出來的“油田污水”成分復(fù)雜，除含原油以外，還溶有各種有害雜質(zhì)，因此，選取生物處理技術(shù)對(duì)廢水進(jìn)行處理，方法有：1.曝氣生物濾池組合工藝法，該方法是在微生物氧化分解作用，填料及生物膜的吸附阻留作用和食物鏈分級(jí)捕食作用以及反硝化作用下共同完成的。相比傳統(tǒng)的活性污泥法，具有生物濃度、有機(jī)負(fù)荷高，占地面積小，過程簡單，成本投入低，抗溫性好，菌群組成合理，耐沖擊性等優(yōu)點(diǎn)。包括：1）膜生物反應(yīng)器—曝氣生物濾池法，它能夠高效快速過濾超濾膜，同時(shí)有效降解高濃度活性污泥生物，且不借助二沉池和污泥回流系統(tǒng)，具有成本小、能耗低以及處理效果好等優(yōu)點(diǎn)。2）超聲氣浮—BAF法，在羥基自由基氧化、氣泡內(nèi)高溫?zé)峤夂统R界水氧化三種因素作用下，利用聲化學(xué)這一邊緣科學(xué)，在大于20Hz的超聲波條件下，提高化學(xué)反應(yīng)速率，超聲波有促進(jìn)有機(jī)污染物降解和提高廢水的可生化性的功能，但單獨(dú)應(yīng)用時(shí)去除廢水中有毒物質(zhì)的能力不高。3）A/O—BAF法，此方法模式是“隔油/氣浮/二級(jí)生化”，處理效果不甚理想。2.氧化溝，氧化溝是在20世紀(jì)中期由荷蘭開發(fā)的一種污水處理工藝，它是在傳統(tǒng)活性污泥法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改造生成的，污水和活性污泥的混合液可在溝渠形的曝氣池中循環(huán)流動(dòng)。其技術(shù)過程簡單，處理效果良好，排放水達(dá)標(biāo)。3.人工濕地，該方法處理污水最初是借助蘆葦之類的人工濕地凈化污水，去除其中大量有機(jī)和無機(jī)物。經(jīng)過發(fā)展，演變?yōu)槔没|(zhì)、微生物和植物，在生態(tài)系統(tǒng)的物理、化學(xué)和生物協(xié)調(diào)作用下，通過過濾、吸附、吸收和分解等一些列過程來凈化廢水，實(shí)現(xiàn)廢水無害化處理目標(biāo)。同時(shí)通過生物地球化學(xué)循環(huán)，有利于綠色植物生長。它在出水水質(zhì)、營養(yǎng)物質(zhì)去除能力、成本費(fèi)用、技術(shù)含量、綜合管理方便等方面具有明顯優(yōu)勢。4.氧化塘，將各類微生物和藻類置于氧化塘中，發(fā)生氧化反應(yīng)后，去除有機(jī)污染物，使其轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機(jī)物。研究表明，它對(duì)油、酚類有機(jī)物、硫化物等的去除效果都較好。5.特種菌類處理，在污水生物處理中，很多細(xì)菌具有特殊功能，這些菌類經(jīng)過分離、培養(yǎng)后，對(duì)有機(jī)物處理有良好效果。

三、生物處理技術(shù)的主要問題及趨勢

目前采用高效降解菌的生物深度處理技術(shù)在含油廢水深度處理領(lǐng)域的研究已取得很大進(jìn)展，但未來發(fā)展中仍存在以下問題，需要重視。體現(xiàn)在：1.由于含油廢水所含有機(jī)物復(fù)雜、繁多的特性，需要結(jié)合各種方法，優(yōu)化各步處理技術(shù)，再找出一套綜合工藝，滿足深度處理技術(shù)高效處理廢水的要求。2.提高含油廢水深度處理器殊菌的濃度與活性。在了解含油廢水成分組成的基礎(chǔ)上，分離、培養(yǎng)各篩選優(yōu)勢菌種，監(jiān)測該菌的最佳降解條件。根據(jù)反饋信息，提高凈化效率。3.基于生物工程技術(shù)的處理效果，創(chuàng)新技術(shù)。提高更有效處理含油廢水的可能性。

國外處理采油廢水的技術(shù)已經(jīng)由單一利用一種方法轉(zhuǎn)變?yōu)槎喾N方法結(jié)合使用，出現(xiàn)了物理化學(xué)方法與生物技術(shù)綜合運(yùn)用，提高了廢水處理效率和達(dá)標(biāo)度。而國內(nèi)多利用二次、三次采油工藝處理廢水，相對(duì)較落后，不能達(dá)到理想的處理效果，為對(duì)油田中這種難降解含油廢水進(jìn)行處理，生物深度處理技術(shù)成為國內(nèi)油田采油廢水處理技術(shù)的發(fā)展趨勢。

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篇8

論文關(guān)鍵詞：固定化微生物技術(shù),污水處理,方法分類,載體

由于固定化微生物技術(shù)可固定經(jīng)篩選出的能降解特定物質(zhì)的優(yōu)勢菌屬，因此該技術(shù)的應(yīng)用能使污水處理系統(tǒng)專一性、耐受性增強(qiáng)，處理效果穩(wěn)定，運(yùn)行管理簡單，降解效率明顯優(yōu)于傳統(tǒng)。因此，近年來固定化微生物技術(shù)已成為各國學(xué)者研究的熱點(diǎn)課題，并且已有部分研究成果由實(shí)驗(yàn)室走向?qū)嶋H應(yīng)用階段。本文就現(xiàn)有的固定化微生物技術(shù)進(jìn)行了分類，介紹了各種固定化微生物技術(shù)所常用的載體在污水處理中的研究與應(yīng)用，對(duì)各種固定化微生物技術(shù)的優(yōu)劣性和適用范圍進(jìn)行了比較與總結(jié)，最后對(duì)該方法在污水處理中的實(shí)際應(yīng)用進(jìn)行了展望。

1 固定化微生物技術(shù)及分類

作者簡介：夏冰，(1985-)，男，江西南豐，青島大學(xué)在讀碩士研究生,主要研究方向?yàn)榄h(huán)境生物技術(shù)。E-mail:meilisanzhu@yahoo.com.cn

固定化微生物技術(shù)是從60年代開始發(fā)展起來的新型技術(shù)。固定化微生物技術(shù)是指用物理或化學(xué)方法將游離微生物細(xì)胞、動(dòng)植物細(xì)胞、細(xì)胞器或酶限制或定位在某一特定空間范圍內(nèi)，保留其固有的催化活性，并能被重復(fù)和連續(xù)使用技術(shù)。采用固定化微生物技術(shù)有以下優(yōu)點(diǎn)：有利于提高生物反應(yīng)器內(nèi)微生物濃度和純度，縮短反應(yīng)所需的時(shí)間，降低處理設(shè)施的工程投資和造價(jià)；有利于反應(yīng)器的固液分離，反應(yīng)易于控制，污泥產(chǎn)生量少；有利于除氮和除去高濃度有機(jī)物或其他難降解的有毒有害物質(zhì)，可免除污泥處理的二次污染等。由于其在廢水處理方面的獨(dú)特優(yōu)勢，在近十幾年獲得了迅速的發(fā)展。它已由原來的單一固定化酶、固定化微生物細(xì)胞發(fā)展到固定化動(dòng)植物細(xì)胞、固定化細(xì)胞器、固定化原生質(zhì)體、固定化微生物分生孢子以及酶與微生物細(xì)胞、好氧微生物與厭氧微生物的聯(lián)合固定化[1]等。

目前固定化微生物技術(shù)的方法分類多種多樣，根據(jù)微生物細(xì)胞與載體的作用力及作用形式、微生物細(xì)胞被固定的狀態(tài)以及載體的性質(zhì)將固定化微生物技術(shù)分為以下五類：吸附法、包埋法、交聯(lián)法、自固定化法和介質(zhì)截留法。

1.1吸附法

吸附法在固定化微生物技術(shù)處理污水中是研究最早、應(yīng)用較廣泛、技術(shù)也較成熟的方法。在大多數(shù)生物膜反應(yīng)器啟動(dòng)的早期，所應(yīng)用的都是吸附法的原理。吸附法包括物理吸附和離子吸附兩類。物理吸附是使用高度吸附能力的硅膠、活性炭等吸附劑將微生物吸附到表面使之固定化；離子吸附則是根據(jù)微生物在解離狀態(tài)下因靜電引力的作用而固著于帶有相異電荷的離子交換劑上。該方法操作簡單,微生物固定過程對(duì)細(xì)胞活性的影響小,條件溫和。但這種方法結(jié)合的細(xì)胞數(shù)量有限,反應(yīng)穩(wěn)定性和重復(fù)性差,所固定的微生物數(shù)目受所用載體的種類及其表面積的限制[2]，所以需要進(jìn)行改進(jìn)。同時(shí)微生物與載體間的吸附強(qiáng)度也不夠牢固,故載體的選擇是關(guān)鍵。

1.2包埋法

包埋法是將微生物細(xì)胞截留在水不溶性的凝膠聚合物孔隙的網(wǎng)絡(luò)空間中,通過聚合作用,或通過離子網(wǎng)絡(luò)形成,或通過沉淀作用,或改變?nèi)軇?、溫度、pH值使細(xì)胞截留。凝膠聚合物的網(wǎng)絡(luò)可以阻止細(xì)胞的泄漏,同時(shí)能讓底物滲入和產(chǎn)物擴(kuò)散出來。包埋法又可分為高分子合成包埋、離子網(wǎng)絡(luò)包埋及沉淀包埋。該法操作簡單，對(duì)微生物活性影響小，可將微生物鎖定在特定的高分子網(wǎng)絡(luò)中，因此制作的固定化微生物小球的強(qiáng)度高。包埋法是目前制備固定化微生物最常用、研究最廣泛的方法。

1.3交聯(lián)法

交聯(lián)法是利用兩個(gè)或兩個(gè)以上的功能基團(tuán)，使微生物菌體相互連接成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，即使功能基團(tuán)直接與微生物細(xì)胞表面的反應(yīng)基團(tuán)如氨基、羥基等進(jìn)行互聯(lián)，形成共價(jià)鍵而達(dá)到固定化的目的。使用該方法,微生物細(xì)胞間的結(jié)合強(qiáng)度高,穩(wěn)定性好,經(jīng)得起溫度和pH 值等的劇烈變化。但是由于在形成共價(jià)鍵的過程中反應(yīng)條件過于劇烈，往往會(huì)對(duì)微生物細(xì)胞的活性造成較大的影響，而且適用于此類固定化的交聯(lián)劑大多比較昂貴，因而其在實(shí)際應(yīng)用中受到一定的限制。

1.4自固定化法

自固定化法又稱為無載體固定化法，這種方法是一種全新的概念:在自絮凝顆粒形成過程中,同時(shí)形成了微生物的適宜生態(tài)環(huán)境,使之有利于微生物代謝之間的協(xié)調(diào)或者說有利于微生物之間生物信息的傳遞[3]。這種方法與其他的固定化方法相比，具有傳質(zhì)擴(kuò)散阻力小，細(xì)胞顆粒整體活性高，固定化方法簡單等優(yōu)勢，將在環(huán)境工程中的污水處理領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[4]。

1.5 介質(zhì)截留法

介質(zhì)截留法是通過特殊的孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)將酶、微生物或動(dòng)植物細(xì)胞等固定截留在具有特定功能的載體內(nèi)，或?qū)⒚?、微生物或?dòng)植物細(xì)胞限制在一定的空間范圍內(nèi)，微生物細(xì)胞不能透過此孔網(wǎng)結(jié)構(gòu)，但底物和產(chǎn)物可以通過，從而實(shí)現(xiàn)廢水的生化反應(yīng)和分離同時(shí)進(jìn)行。介質(zhì)截留法可以通過控制介質(zhì)的孔徑選擇性的控制底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散，防止微生物細(xì)胞的泄露，可以使基質(zhì)與微生物細(xì)胞充分接觸，從而有效的反應(yīng)。所以介質(zhì)截留法是一項(xiàng)很有發(fā)展前景的工藝。

2 載體的特點(diǎn)

要完成微生物的固定化，關(guān)鍵是要選擇一種合適的微生物載體。不同的固定化微生物技術(shù)方法需要不同種類的載體。雖然隨著材料學(xué)與生物學(xué)的不斷發(fā)展與結(jié)合，關(guān)于各種固定化微生物方法的最適載體有待進(jìn)一步的研究與討論，但所有載體都應(yīng)具備如下特點(diǎn)：（1）具有抗物理降解、抗化學(xué)降解、抗生物降解的穩(wěn)定性，具有一定的機(jī)械強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。在一定PH值和溫度下，不容易被破壞。（2）固定化方法簡單、易行，固定化條件盡可能溫和。（3）能夠控制固定化微生物顆粒的大小和孔隙度。（4）載體所使用的材料價(jià)廉易得，固定化成本低。（5)固定化系統(tǒng)使底物、產(chǎn)物和其他代謝產(chǎn)物能夠自由擴(kuò)散。（6)載體對(duì)微生物來說是惰性的，不會(huì)損傷細(xì)胞。（7)單位體積的固定化系統(tǒng)擁有盡可能多的微生物，以便更好地起到生物催化作用。

3 固定化微生物技術(shù)的展望

各種固定化方面都有自身的優(yōu)缺點(diǎn)，沒有一種在所有污水處理中都適用的方法，在實(shí)際應(yīng)用中要根據(jù)污水水質(zhì)、水力負(fù)荷、操作條件等情況選擇合適的方法。表一列舉了各種固定化方法的比較。

表1 各種固定化方法的比較

Table 1 the comparison of immobilized microorganisms manner

 

性能        吸附法       包埋法       交聯(lián)法     自固定化法      介質(zhì)截留法  

固化成本         低          低         適中       低             適中             

制備難度         易          適中       適中       易             適中             

穩(wěn)定性能         低          高         高         低             高               

結(jié)合能力         弱          適中       強(qiáng)         適中           高               

存活能力         高          高         低         適中           高               

活性保留         高          適中       低         高             高               

適用性能         適中        大         小         大             適中             

篇9

脊柱椎體的壓縮性骨折是骨質(zhì)疏松患者最常見的并發(fā)癥，嚴(yán)重的椎體壓縮性骨折保守治療5 a內(nèi)死亡率可達(dá)23％～34％，目前常用的手術(shù)治療包括椎體撐開后單純植骨固定和（或）同時(shí)進(jìn)行堅(jiān)強(qiáng)內(nèi)固定材料進(jìn)行固定等，手術(shù)創(chuàng)傷大，并發(fā)癥也多。經(jīng)皮椎體成形術(shù)（percutaneous vertebroplasty，PVP）與后凸成形術(shù)（percutaneous kyphoplasty，PKP）是脊柱外科近來發(fā)展迅速的一項(xiàng)新型微創(chuàng)外科技術(shù)，通過經(jīng)皮向壓縮骨折椎體內(nèi)直接注入（PVP）或者先通過球囊擴(kuò)張?jiān)僮⑷耄≒KP）骨水泥等填充物，從而增強(qiáng)病變椎體的力學(xué)穩(wěn)定性，臨床應(yīng)用證實(shí)其有穩(wěn)定可靠、迅速有效的治療效果，且并發(fā)癥少，但到目前為止長期臨床隨訪資料還不足，椎體成形術(shù)后脊柱生物力學(xué)的研究也發(fā)現(xiàn)了一些問題，椎體成形技術(shù)還需要不斷的改進(jìn)和探索，特別是材料的發(fā)展對(duì)減小椎體成形術(shù)的并發(fā)癥發(fā)生率和改善術(shù)后脊柱的生物力學(xué)特性起著關(guān)鍵的作用。

1 PVP和PKP的充填材料研究進(jìn)展

應(yīng)用于椎體成形的充填材料主要包括注射型聚甲基丙烯酸甲酯（polymethylmethacrylate，PMMA）、復(fù)合骨水泥如玻璃陶瓷強(qiáng)化復(fù)合骨水泥（Orthocomp）、Cortoss（Orthovia）、Hydroxyapatite composite resin（Kuraray）以及可生物降解的骨水泥如天然珊瑚骨替代物和磷酸鈣骨水泥（calcium phosphate cement，CPC）等。

11 PMMA

具有粘稠度低，容易灌注，能快速提供需要的椎體強(qiáng)度和剛度，價(jià)格較便宜等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)在仍是目前臨床上椎體成形術(shù)較常用的材料，但其有一定的局限性：（1）粘滯性較低，滲漏是最常見的并發(fā)癥，向后方滲漏入椎管可壓迫脊髓，嚴(yán)重時(shí)可滲漏入血管沿靜脈回流引起肺栓塞，甚至導(dǎo)致患者死亡；（2）放熱反應(yīng)：PMMA聚合時(shí)產(chǎn)熱可對(duì)周圍組織造成熱燒傷，有研究顯示骨水泥聚合時(shí)的溫度在椎體前部達(dá)44～113 ℃，在椎體中心達(dá)49～112 ℃，椎管內(nèi)達(dá)39～57 ℃，而溫度超過50 ℃的滯留時(shí)間分別可達(dá)55、8min和25 min〔1〕；（3）缺乏骨傳導(dǎo)性和生物活性，無法生物降解，后期可出現(xiàn)骨水泥與骨質(zhì)界面的松動(dòng)；（4）PMMA注射后的椎體與臨近椎體的力學(xué)強(qiáng)度差異大，易導(dǎo)致臨近椎體的骨折;（5）有毒單體的釋放和PMMA碎屑的作用使細(xì)胞的生長、DNA的合成和糖代謝受到抑制而具有細(xì)胞毒性，其單體毒性可引起患者血壓驟降，從而引起患者猝死的可能。另外，還有致敏、局部組織抗感染能力降低、致腫瘤等不良反應(yīng)。為了提高其機(jī)械性能和生物相容性，近年已有將具有生物活性的無機(jī)顆?；蚶w維增強(qiáng)的高分子骨粘合劑加入PMMA來提高其生物相容性的報(bào)道，但仍然不滿意，其機(jī)械強(qiáng)度降低較快。

12 復(fù)合骨水泥

如Orthocomp、Cortoss、Hydroxyapatite composite resin（Kuraray）等與PMMA具有相似的基本性質(zhì)，但較PMMA有更合適的粘稠度、X線的不透射性、硬化快、產(chǎn)熱低、具有更好的力學(xué)性能、生物活性及骨誘導(dǎo)性等優(yōu)點(diǎn)。Cortoss是一種新型合成骨腔填充物，容易彌散進(jìn)入松質(zhì)骨，彈性模量與骨相近。Orthocomp是一種玻璃陶瓷增強(qiáng)的多種基質(zhì)復(fù)合物骨水泥，雖然為不可吸收材料，但其具有親水性的表面，使骨水泥可以通過化學(xué)鍵與松質(zhì)骨連結(jié)。Jasper等研究發(fā)現(xiàn)Orthocomp的強(qiáng)度和剛度是PMMA骨水泥的2倍左右〔2〕。Belkoff等也研究表明Orthocomp對(duì)椎體的強(qiáng)度和剛度都有較好的恢復(fù)。Lu等介紹了一種含鍶羥基磷灰石粉末和BisGMA（bisphenol A diglycidylether dimethacrylate）的復(fù)合骨水泥，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭羞M(jìn)行30 000和20 000次的疲勞載荷測試后，骨水泥成形椎體的剛度與對(duì)照組相比分別下降75％和56％，平均抗壓極限載荷分別為5 056 N和5 301 N〔3〕。

13 磷酸鈣類骨水泥（CPC）

CPC具有任意塑形、自行固化、生物相容、逐步降解等特性，較PMMA有更好的生物相容性、骨傳導(dǎo)性和粘滯度。新骨的替代方式由CPC的表面向深層逐漸推進(jìn)，6個(gè)月時(shí)平均長入深度為6 mm，12個(gè)月時(shí)為114 mm。CPC可能是椎體成形術(shù)更好的注入材料，但在體內(nèi)的應(yīng)用及長期生物力學(xué)和生物效應(yīng)還需要進(jìn)一步的研究〔4、5〕。Heini和Lim等〔6、7〕研究認(rèn)為CPC及改良的CPC在體內(nèi)成形過程中產(chǎn)熱明顯減少，并且具有良好的彌散能力，可以明顯增強(qiáng)骨質(zhì)疏松椎體的抗壓強(qiáng)度和剛度。其本身的強(qiáng)度低于正常椎體，但高于骨質(zhì)疏松椎體，在成形術(shù)后可以減小因椎體的剛度變化而導(dǎo)致上下緣椎體骨折的幾率〔8〕。CPC固化后的微孔結(jié)構(gòu)具有引導(dǎo)新骨形成能力，但無誘導(dǎo)成骨活性，生物活性CPC利用其固化過程溫和的特性，將骨形態(tài)生長蛋白BMP與CPC均相負(fù)荷，使材料在充填修復(fù)的同時(shí)加速CPC的降解和促進(jìn)成骨作用。然而，Heini等認(rèn)為CPC的生物降解也會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的問題，治療骨質(zhì)疏松椎體壓縮骨折時(shí)，骨水泥快速吸收會(huì)削弱椎體并導(dǎo)致其進(jìn)一步塌陷〔9〕。

Cunin應(yīng)用一種具有多孔狀結(jié)構(gòu)的天然珊瑚加入骨誘導(dǎo)因子BMP進(jìn)行研究，認(rèn)為顆粒狀的天然珊瑚具有可注射性、生物相容性和骨誘導(dǎo)性，但其生物力學(xué)特性還需進(jìn)一步研究〔7〕。最近有報(bào)道用MMA（methyl methacrylate）處理的SrHAC（strontiumcontaining hydroxyapatite cement）對(duì)椎體剛度、壓縮強(qiáng)度、彎曲強(qiáng)度和楊氏系數(shù)的恢復(fù)都具有很好的效果〔10〕。

2 PVP和PKP的生物力學(xué)研究

椎體成形術(shù)的短期療效十分令人鼓舞，也推動(dòng)了PVP和PKP在臨床的發(fā)展，Garfin等報(bào)道了從1998年10月～2000年5月由多家醫(yī)院參與的臨床研究結(jié)果，共340例，603個(gè)椎體，隨訪最長18個(gè)月，超過90％的患者癥狀改善。有人對(duì)13例經(jīng)過經(jīng)皮椎體成形術(shù)的患者進(jìn)行了長達(dá)5 a的隨訪觀察，結(jié)果臨床療效顯著，5 a的長期隨訪發(fā)現(xiàn)VAS（visual analogue scale）評(píng)分略升高，但仍然明顯低于術(shù)前水平，未發(fā)現(xiàn)成形椎體的進(jìn)一步壓縮〔11〕。近年來對(duì)于椎體成形術(shù)后脊柱的生物力學(xué)研究顯示椎體成形術(shù)后對(duì)于脊柱整體特別是臨近椎體的影響還是顯著的。對(duì)椎體成形術(shù)后脊柱的生物力學(xué)研究對(duì)于正確應(yīng)用椎體成形術(shù)十分有幫助，并對(duì)臨床應(yīng)用進(jìn)行正確的指導(dǎo)。

21 術(shù)后骨折椎體的生物力學(xué)性質(zhì)

PMMA或磷酸鈣椎體成形后的生物力學(xué)研究證實(shí)骨折椎體成形后的穩(wěn)定性參數(shù)顯著提高〔12〕，可防止椎體的進(jìn)一步塌陷和變形。椎體壓縮骨折后降低了運(yùn)動(dòng)節(jié)段的椎體壓縮強(qiáng)度，增加后柱的負(fù)荷而引起疼痛，通過對(duì)尸體模型的測量發(fā)現(xiàn)病變椎體后柱的壓力負(fù)荷在屈曲時(shí)增高21％、42％，后伸時(shí)增加39％~68％，椎體成形術(shù)后則使脊柱屈曲時(shí)后柱的壓力負(fù)荷減小26％，后伸時(shí)減小61％，結(jié)果示椎體骨折前和成形術(shù)后的神經(jīng)弓壓力無明顯差異，全部或部分的逆轉(zhuǎn)了后部結(jié)構(gòu)的壓力負(fù)荷，從而使疼痛癥狀立即緩解〔13〕。

22 充填材料與骨折椎體生物力學(xué)的關(guān)系

基于骨水泥注入越多椎體可以得到更好強(qiáng)化的觀念，有些臨床醫(yī)生在病變椎體內(nèi)注入最大劑量的骨水泥來提高其椎體抗壓強(qiáng)度，有人報(bào)道在尸體標(biāo)本中可以注入椎體容積70％的骨水泥〔14〕。椎體成形后的強(qiáng)度越大，對(duì)上下位椎體的應(yīng)力也越強(qiáng)，使臨近椎體的骨折發(fā)生率增高，特別是在高齡骨質(zhì)嚴(yán)重疏松患者。成形術(shù)后臨近椎體有抗壓縮力下降及椎體間移位等改變，并且臨近椎體抗壓力下降的程度與成形術(shù)時(shí)注入的骨水泥量相關(guān)〔15、16〕。是否注入的骨水泥量越大，椎體的抗壓強(qiáng)度和剛度就越高?Molloy，S等對(duì)120個(gè)椎體（T6~L5）注入2~8 ml不等量的骨水泥，研究發(fā)現(xiàn)注入量與椎體抗壓強(qiáng)度和剛度的恢復(fù)只有弱相關(guān)（r2分別為021和027），抗壓強(qiáng)度和剛度的恢復(fù)平均只需要注入椎體容積的162％和298％〔17〕。注入的骨水泥量越大，滲漏的幾率則越高。Belkog等〔18〕人對(duì)骨質(zhì)疏松女性尸體的椎體建立壓縮性骨折模型，用Orthocomp或Simplex P作為充填材料，結(jié)果僅需2 ml即可恢復(fù)椎體的壓縮強(qiáng)度，而椎體剛度的恢復(fù)與水泥充填容量缺乏相關(guān)關(guān)系。減小骨水泥的注入量同時(shí)可縮短注入時(shí)間，明顯降低骨水泥滲漏的危險(xiǎn)。也有人報(bào)道椎體成形術(shù)后椎體剛度的恢復(fù)與注入的骨水泥量相關(guān)，14％容積的骨水泥就可滿足剛度恢復(fù)的要求，30％容積的骨水泥注入則可使剛度明顯增加，使臨近椎體的骨折危險(xiǎn)增加〔19〕。

不同的充填材料對(duì)椎體生物力學(xué)性質(zhì)的影響也有不同。Belkoff等人先后對(duì)Simplex P，Cranoplastic，Osteobond，Orthocomp等不同材料進(jìn)行椎體成形術(shù)后的椎體生物力學(xué)研究，結(jié)果顯示Simplex P、Osteobond及Orthocomp能有效恢復(fù)椎體的剛度和壓縮強(qiáng)度，而Cranoplastic則僅能增加壓縮強(qiáng)度，不能恢復(fù)椎體的剛度，且在剛度的恢復(fù)程度上Orthocomp優(yōu)于Simplex P〔20、21〕。新型材料CPC能明顯恢復(fù)骨質(zhì)疏松椎體的抗壓強(qiáng)度，對(duì)剛度的恢復(fù)也較好，CPC的微孔結(jié)構(gòu)可以使新骨長入，使其具有更好的生物相容性。對(duì)羥基磷灰石骨水泥（HA）充填椎體后的生物力學(xué)測試表明其對(duì)壓縮強(qiáng)度的恢復(fù)滿意，但對(duì)剛度的恢復(fù)作用小。MMA處理的SrHAC不僅有利于界面的融合，對(duì)椎體剛度、壓縮強(qiáng)度、彎曲強(qiáng)度和楊氏系數(shù)的恢復(fù)都具有很好的效果，而且明顯優(yōu)于單純的SrHAC〔10〕。

23 PVP和PKP兩種術(shù)式的生物力學(xué)比較

Belkoff等先后兩次進(jìn)行了關(guān)于后凸成形術(shù)的體外生物力學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)無論在有無載荷的情況下后凸成形術(shù)均能部分恢復(fù)椎體的高度，恢復(fù)椎體的強(qiáng)度。它在無載荷的情況下可以恢復(fù)丟失高度的97％，而椎體成形術(shù)僅能恢復(fù)30％，兩種方法都能明顯增強(qiáng)椎體的強(qiáng)度。Belkoff對(duì)16個(gè)椎體隨機(jī)分為PVP和PKP治療組，結(jié)果顯示PKP組能恢復(fù)椎體的起始剛度，而PVP則不能，PKP與PVP相比，不僅能有效恢復(fù)椎體的高度，而且能恢復(fù)椎體的壓縮強(qiáng)度和剛度〔22〕。但也有不同觀點(diǎn)，Tomita等對(duì)30個(gè)骨質(zhì)疏松椎體隨機(jī)分為4組：（1）PKP+CPC；（2）PKP+PMMA；（3）PVP+CPC；（4）PVP+PMMA，術(shù)前及術(shù)后對(duì)椎體強(qiáng)度和剛度的分析顯示各組對(duì)椎體強(qiáng)度的恢復(fù)都較好，但對(duì)椎體剛度的恢復(fù)PKP組不及PVP組〔23〕。對(duì)于PVP和PKP術(shù)后的生物力學(xué)差異還有待進(jìn)一步研究。

24 預(yù)防性應(yīng)用椎體成形術(shù)可行性研究

水平骨小梁的丟失和骨小梁間空隙的增大降低了椎體的壓縮強(qiáng)度，這與骨礦物質(zhì)含量和密度高度相關(guān)，椎體成形術(shù)的確切療效也僅在骨折疏松性骨折中發(fā)現(xiàn)，術(shù)后椎體的抗壓能力能夠通過注入骨水泥而顯著增強(qiáng)，但在正常BMD（bone mineral density）的椎體，成形術(shù)前后則沒有明顯差別。Skos Pheumaticos等對(duì)4個(gè)新鮮脊柱共40個(gè)正常椎體進(jìn)行椎體注入了PMMA與不注入PMMA的生物力學(xué)研究顯示未進(jìn)行成形術(shù)的椎體最大負(fù)荷為（6 72402±3 29170）N，然而注入了PMMA的椎體最大負(fù)荷為（5 770504±2 13372）N，兩組間統(tǒng)計(jì)學(xué)上無明顯區(qū)別。這提醒對(duì)有椎體骨折高?；颊哌M(jìn)行預(yù)防性的椎體成形術(shù)治療可能是不可取的〔24〕。在骨折椎體上下緣椎體注入適當(dāng)?shù)墓撬鄟砭徑庾刁w間強(qiáng)度差異，是否可以減少因?yàn)樽刁w間應(yīng)力不平衡導(dǎo)致的骨折以及是否能夠更有效的維持脊柱的生物力學(xué)穩(wěn)定性還有待進(jìn)一步的研究。但對(duì)于有嚴(yán)重骨質(zhì)疏松患者的椎體壓縮性骨折，也有在包括骨折椎體共4個(gè)椎體注入PMMA（其中骨折椎體為T6、7，注入骨水泥椎體T6~9）〔25〕。近來陸續(xù)有對(duì)骨質(zhì)疏松患者預(yù)防性注入骨水泥來提高椎體強(qiáng)度可行性的研究。Sun，K等研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)高?；颊咦⑷胫辽僮刁w容積20％的骨水泥才能有效減少其骨折風(fēng)險(xiǎn)，而對(duì)中等程度危險(xiǎn)度患者則需要注入椎體容積5％～15％的骨水泥，而這種預(yù)防性治療和骨折后進(jìn)行椎體成形術(shù)治療的并發(fā)癥發(fā)生率并無太大區(qū)別〔26〕。

25 椎體成形術(shù)后臨近椎體的生物力學(xué)改變

對(duì)椎體成形術(shù)后的生物力學(xué)研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)其不足之處，特別是對(duì)上下緣椎體的影響較為明顯。椎體成形術(shù)的目的為最大程度上的恢復(fù)壓縮椎體的剛度和抗壓強(qiáng)度，但對(duì)椎體強(qiáng)度的恢復(fù)或增強(qiáng)，可能是臨近椎體骨折的重要原因，因其可使上下緣椎體所受壓力升高〔27〕。

Bertemann等對(duì)10例人體新鮮標(biāo)本相鄰椎體共20對(duì)，隨機(jī)分成2組，一組下緣椎體注射PMMA，另一組設(shè)為對(duì)照，對(duì)上緣椎體負(fù)荷的生物力學(xué)研究顯示，2組上緣椎體在低于臨界負(fù)荷下與對(duì)照組無明顯差別，但在臨界負(fù)荷時(shí)實(shí)驗(yàn)組壓力平均低于對(duì)照組19％，在實(shí)驗(yàn)組中，骨折總發(fā)生在成形椎體的上緣椎體〔28〕。臨床上也有椎體成形術(shù)后上下臨近椎體骨折的報(bào)道〔15、29〕。在APerezHigueras等對(duì)13例經(jīng)過經(jīng)皮椎體成形術(shù)的患者進(jìn)行5 a長期隨訪觀察得出臨床療效顯著的同時(shí)也發(fā)現(xiàn)有2例發(fā)生臨近椎體骨折〔11〕。對(duì)1組平均年齡74歲的椎體成形術(shù)后患者研究顯示，臨近椎體發(fā)生骨折概率每年遞增66％。其下緣椎體有一個(gè)或多個(gè)椎體骨折時(shí)，第1 a發(fā)生骨折的危險(xiǎn)性提高了約5倍，在椎體骨折后的1 a里發(fā)生新的骨折的概率約192%〔30〕。

如前所述，椎體骨折可能與臨近椎體的強(qiáng)度增加有關(guān)。對(duì)L4、5椎體的研究發(fā)現(xiàn)椎體成形術(shù)后堅(jiān)硬的骨水泥對(duì)椎體上緣的終板造成約7％的壓縮，使椎間盤內(nèi)壓力較正常增高了19％，特別是在脊柱負(fù)荷增高時(shí)，椎間關(guān)節(jié)活動(dòng)度下降11％，上緣椎體下終板內(nèi)凸增加17％，這可能是導(dǎo)致成形術(shù)后臨近椎體骨折的原因〔31〕。由于患者術(shù)后疼痛的減輕，改變了生活方式，脊柱運(yùn)動(dòng)量和負(fù)荷增加，也使椎體骨折的幾率增加。同時(shí)與成形術(shù)后椎體臨近的椎間盤內(nèi)壓力升高也使椎間盤突出的危險(xiǎn)性增加。

不同材料的使用對(duì)臨近椎體生物力學(xué)影響不同。一般而言，松質(zhì)骨彈性模量為168 MPa，PMMA則為2 700 MPa，CPC彈性模量在180 MPa左右，CPC較PMMA在避免應(yīng)力遮擋效應(yīng)和載荷傳遞異常以及減少相鄰椎體繼發(fā)骨折方面有優(yōu)越性。有研究顯示CPC椎體成形后，相鄰椎間盤應(yīng)力沒有明顯變化，應(yīng)力遮擋和異常載荷傳遞效應(yīng)甚微，相比PMMA、CPC椎體成形術(shù)在降低相鄰椎體骨折發(fā)生率方面有潛在的優(yōu)勢。

到目前為止，對(duì)椎體成形術(shù)后與未進(jìn)行椎體成形術(shù)時(shí)對(duì)臨近椎體發(fā)生骨折的危險(xiǎn)性是否增高還未見完全隨機(jī)試驗(yàn)的研究，然而臨近椎體的骨折也許是嚴(yán)重骨質(zhì)疏松的自然進(jìn)程，特別是臨近椎體有相似的機(jī)械和形態(tài)學(xué)特征。但近來相繼有報(bào)道椎體成形術(shù)后臨近椎體的力學(xué)性質(zhì)下降，可能增加骨折的危險(xiǎn)性。填充材料的發(fā)展可以有效增強(qiáng)骨折椎體的抗壓能力和維持良好的形態(tài)學(xué)特征，并可能使骨折椎體的生物力學(xué)性質(zhì)恢復(fù)到最佳的狀態(tài)。

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