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篇1

英文名稱：Beijing Biomedical Engineering

主管單位：衛(wèi)生局

主辦單位：北京生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會;北京心肺血管疾病研究所

出版周期：雙月刊

出版地址：北京市

語

種：中文

開

本：16開

國際刊號：1002-3208

國內(nèi)刊號：11-2261/R

郵發(fā)代號：

發(fā)行范圍：國內(nèi)外統(tǒng)一發(fā)行

創(chuàng)刊時間：1981

期刊收錄：

核心期刊：

中文核心期刊(1992)

期刊榮譽(yù)：

聯(lián)系方式

篇2

[關(guān)鍵詞]課堂教學(xué) 實驗設(shè)計 課程設(shè)計 工程實踐 人才培養(yǎng)

近年來，隨著計算機(jī)技術(shù)和電子技術(shù)的飛速發(fā)展，單片機(jī)與嵌入式系統(tǒng)產(chǎn)品以其高性能、低功耗、應(yīng)用方案靈活、成本低廉等諸多優(yōu)點，在工業(yè)控制、軍事國防、航空航天、網(wǎng)絡(luò)通信、消費(fèi)電子等行業(yè)發(fā)揮著重要作用，廣泛應(yīng)用于各個科技領(lǐng)域和日常生活的每個角落。在生物醫(yī)學(xué)工程專業(yè)，嵌入式系統(tǒng)在生理參數(shù)測量、傳輸、監(jiān)測，在完善醫(yī)療輔助設(shè)備，以及研發(fā)新型醫(yī)療儀器等方面都有著重要應(yīng)用。

本文針對生物醫(yī)學(xué)工程專業(yè)本科生，在單片機(jī)嵌入式系統(tǒng)課程教學(xué)過程中存在的問題，提出了一系列教學(xué)改革措施，改善工程實踐性很強(qiáng)的課程教學(xué)效果，使學(xué)生在有限的時間里獲得最大的收獲，在嵌入式系統(tǒng)應(yīng)用和設(shè)計等方面獲得豐富的實踐經(jīng)驗。

一、單片機(jī)教學(xué)實踐中存在的主要問題

嵌入式系統(tǒng)開發(fā)的難度較大，門檻較高，往往要求研發(fā)者具備良好的軟硬件知識和設(shè)計、開發(fā)、調(diào)試、測試技能，以及扎實的專業(yè)知識。如何培養(yǎng)出具備扎實的基礎(chǔ)理論知識和實踐開發(fā)能力的高素質(zhì)研究型人才是學(xué)校嵌入式教學(xué)的首要任務(wù)[1]。

單片機(jī)與嵌入式技術(shù)課程知識結(jié)構(gòu)復(fù)雜，涉及的內(nèi)容繁多，實踐性強(qiáng)。大學(xué)生如果能夠掌握相關(guān)技術(shù)，就能成為滿足實際研發(fā)需要的復(fù)合型工程技術(shù)人才。但是目前大學(xué)嵌入式人才培養(yǎng)和教學(xué)與企業(yè)科研需求之間存在一定的偏差，造成學(xué)生的創(chuàng)新精神和實踐動手能力不足，導(dǎo)致理論學(xué)習(xí)與人才需求出現(xiàn)了脫鉤[2，3]。主要問題表現(xiàn)在：

（1） 授課內(nèi)容過時、枯燥，不能緊跟嵌入式技術(shù)最新發(fā)展現(xiàn)狀，不能滿足實際需要；

（2） 對嵌入式操作系統(tǒng)的講授和配套實驗內(nèi)容嚴(yán)重不足；

（3） 綜合設(shè)計性實驗較少，不注重學(xué)生的綜合應(yīng)用能力培養(yǎng)；

（4） 實驗設(shè)計內(nèi)容單一，不具備研發(fā)價值。

二、教學(xué)改革實踐

作為全國最早開設(shè)生物醫(yī)學(xué)工程專業(yè)的學(xué)校，單片機(jī)教學(xué)始終是最重要的專業(yè)選修課之一，目前課程以ARM-V4版的RM7TDMI-S內(nèi)核為核心，以飛利浦公司的LPC2000系列單片機(jī)為應(yīng)用目標(biāo)，在教學(xué)內(nèi)容、互動教學(xué)、實驗設(shè)置、創(chuàng)新實踐等方面進(jìn)行了積極的探索和研究，使傳統(tǒng)的專業(yè)實踐課程煥發(fā)出新的光彩。

（一）堅持理論與實踐相結(jié)合的教學(xué)模式

大學(xué)學(xué)習(xí)內(nèi)容應(yīng)該以理論學(xué)習(xí)為主，尤其是針對32位ARM單片機(jī)，必須搞清楚ARM7內(nèi)核的基本結(jié)構(gòu)，7種處理器工作模式的定義及特點，標(biāo)準(zhǔn)32位ARM指令和16位的Thume指令使用，主要寄存器與基本外設(shè)定義等知識點，學(xué)習(xí)理解這些基本概念對于掌握32位ARM單片機(jī)的工作原理，舉一反三，進(jìn)而熟悉相關(guān)單片機(jī)應(yīng)用技術(shù)提供了重要的基礎(chǔ)理論保障。

在程序設(shè)計方面采用大量程序設(shè)計實例，在講授程序設(shè)計思想的同時加速理解匯編語言使用方法，初步學(xué)習(xí)C交叉匯編語言程序設(shè)計方法，為后續(xù)硬件系統(tǒng)實驗奠定基礎(chǔ)；在講述硬件系統(tǒng)設(shè)計時，圍繞單片機(jī)主要外設(shè)類型，不拘泥于具體單片機(jī)型號，以不同外設(shè)的基本工作原理和控制寄存器為主要內(nèi)容，同時增加應(yīng)用實例，提高學(xué)習(xí)興趣和學(xué)習(xí)效果；在課程配套實驗設(shè)計方面，更加關(guān)注實驗教學(xué)模式和實驗內(nèi)容設(shè)計[4，5]，從操作技能學(xué)習(xí)到認(rèn)知技能學(xué)習(xí)，按照學(xué)生實踐技能學(xué)習(xí)基本規(guī)律，設(shè)計實現(xiàn)了7個共16個課時的實驗內(nèi)容，包括了IO接口、基本外設(shè)，操作系統(tǒng)移植，數(shù)字信號處理，綜合系統(tǒng)設(shè)計等實驗內(nèi)容，涵蓋了嵌入式單片機(jī)系統(tǒng)主要技術(shù)要點，使學(xué)生在有限時間里就可對單片機(jī)應(yīng)用技術(shù)有一個較全面的學(xué)習(xí)和能力培養(yǎng)。

（二）利用優(yōu)勢資源，豐富教學(xué)內(nèi)容

針對課程實踐性很強(qiáng)的特點，我們結(jié)合學(xué)?？蒲许椖浚瑢η度胧较到y(tǒng)在醫(yī)學(xué)儀器設(shè)計應(yīng)用方面進(jìn)行了卓有成效的實踐，突出了課程教學(xué)的實用性，強(qiáng)化了學(xué)習(xí)內(nèi)容的工程觀念，取得了很好的教學(xué)效果。

我們將多參數(shù)生命參數(shù)監(jiān)護(hù)系統(tǒng)設(shè)計引入課堂教學(xué)，其硬件單元主要包括生理數(shù)據(jù)采集、ARM內(nèi)核、人機(jī)接口、SD卡存儲器、GPRS、GPS、電源管理等模塊，系統(tǒng)從溫度傳感器電路等模擬電路設(shè)計，到大容量鋰離子電池優(yōu)化和電源模塊設(shè)計，從系統(tǒng)數(shù)據(jù)存儲結(jié)構(gòu)設(shè)計，到遠(yuǎn)程通訊規(guī)約設(shè)計、地理信息使用。在介紹這些軟硬件功能模塊基礎(chǔ)上，再引入嵌入式實時操作系統(tǒng)μC/OS-Ⅱ，按照設(shè)備依賴性、關(guān)鍵性、緊迫性等任務(wù)劃分原則構(gòu)成一套多任務(wù)系統(tǒng)，逐步引入任務(wù)設(shè)計、時間管理、中斷管理、內(nèi)存管理、進(jìn)程管理與同步，資源同步、數(shù)據(jù)管理等關(guān)鍵知識內(nèi)容，使學(xué)生在6-8個課時內(nèi)學(xué)習(xí)熟悉一種實際應(yīng)用系統(tǒng)設(shè)計方法，加深對所學(xué)知識和應(yīng)用環(huán)境的正確理解。

（三）重視互動教學(xué)，追求質(zhì)量卓越

由于課時的限制，大量增加實踐教學(xué)內(nèi)容是有一定困難的，為了能夠達(dá)到預(yù)期教學(xué)目標(biāo)，增加了課程設(shè)計的內(nèi)容，希望通過課外閱讀和研究，鞏固嵌入式單片機(jī)的教學(xué)內(nèi)容，增強(qiáng)學(xué)生對嵌入式系統(tǒng)在日常生活中的應(yīng)用技能，課程設(shè)計的完成質(zhì)量則要通過PPT答辯互動，師生共同評分進(jìn)行保障，使單個設(shè)計內(nèi)容通過交流互動達(dá)到全體共享，互相學(xué)習(xí)的目的。

課程設(shè)計包括三個設(shè)計任務(wù)，2人一組，每組選擇一個任務(wù)題目進(jìn)行研究設(shè)計，表1是部分課程設(shè)計題目，任務(wù)要求如下：

表1：單片機(jī)與嵌入式系統(tǒng)課程設(shè)計任務(wù)選編

①完成一項有關(guān)單片機(jī)及嵌入式系統(tǒng)在日常生活方面應(yīng)用的項目設(shè)計，要求有明確的設(shè)計目標(biāo)，具體可行的設(shè)計參數(shù)和可能達(dá)到的技術(shù)指標(biāo)。

②針對一種嵌入式操作系統(tǒng)進(jìn)行深入的介紹和移植方法的研究。要求內(nèi)容包括內(nèi)核特點，進(jìn)程管理，內(nèi)存管理，移植方法、BSP（board support package）編程等。

③針對多種嵌入式操作系統(tǒng)進(jìn)行深入的對比研究和綜述，選擇4種以上的操作系統(tǒng)，主要從任務(wù)調(diào)度機(jī)制，數(shù)據(jù)同步和通訊機(jī)制比較，內(nèi)存及數(shù)據(jù)架構(gòu)與管理，支持的硬件功能，中斷管理，實時性，市場份額，發(fā)展前景等多項參數(shù)進(jìn)行對比研究。

通過2個月時間的研究準(zhǔn)備，在學(xué)期末進(jìn)行全體師生共同參加的課程設(shè)計答辯會，由一位同學(xué)進(jìn)行PPT講解，另一位同學(xué)負(fù)責(zé)回答質(zhì)詢問題?？己顺煽儼凑?0分標(biāo)準(zhǔn)，由全體同學(xué)打分，并與教師分?jǐn)?shù)加權(quán)計算后再進(jìn)行歸一化處理，使答辯評分更加客觀合理。

（四）結(jié)合學(xué)科競賽，加強(qiáng)實踐創(chuàng)新人才培養(yǎng)

單片機(jī)的教學(xué)可以貫穿于整個高年級教學(xué)實踐活動中，在課程教學(xué)之外，通過鼓勵學(xué)生積極參加電子創(chuàng)新類學(xué)科競賽，鼓勵學(xué)生進(jìn)入實驗室進(jìn)行創(chuàng)新科技活動，在具體科研實踐中使學(xué)生獲得更多更豐富的專業(yè)知識，進(jìn)行科研能力的培養(yǎng)[6]。

在大學(xué)生創(chuàng)新實驗項目“超聲注射藥物溶解加速器”研發(fā)過程中，小組5名同學(xué)從系統(tǒng)的設(shè)計思想、模塊規(guī)劃、硬件構(gòu)成、功能設(shè)計、軟件設(shè)計等項目內(nèi)容進(jìn)行了深入的研制工作，以MSP430單片機(jī)為主體，構(gòu)建了包括反饋采樣、鍵盤顯示，頻率合成、高頻功率放大、匹配電路和超聲換能器等組成的系統(tǒng)硬件，僅軟件程序就達(dá)450余行，系統(tǒng)通過藥物對比實驗，對整個加速溶解系統(tǒng)進(jìn)行了綜合測試，取得了明顯加速藥物溶解的效果，并取得了國家發(fā)明專利授權(quán)。

在“生物醫(yī)學(xué)工程教學(xué)仿真人系統(tǒng)”項目中，利用單片機(jī)技術(shù)模擬產(chǎn)生人體真實生理信號，通過對生理信號進(jìn)行采樣，預(yù)處理，無線發(fā)射到主機(jī)模塊，并通過LabVIEW設(shè)計上位機(jī)多參數(shù)生理監(jiān)護(hù)軟件，實現(xiàn)了經(jīng)人體生理參數(shù)動態(tài)采集顯示。該系統(tǒng)設(shè)計思想來源于醫(yī)學(xué)儀器課堂教學(xué)，最終通過將其回饋應(yīng)用于課堂教學(xué)和實驗教學(xué)，對學(xué)生的理論知識起到了積極的作用。

三、小結(jié)

嵌入式系統(tǒng)是一個朝氣蓬勃、發(fā)展迅速的專業(yè)領(lǐng)域，人才稀缺，門檻較高，針對目前課堂教學(xué)與實踐教學(xué)存在的種種不足，我們深刻體會到必須改變單一的課堂教學(xué)模式和刻板的被動灌輸式教學(xué)方法，在課堂教學(xué)中我們注意到既要重視基礎(chǔ)理論內(nèi)容的教學(xué)，在有限的課時內(nèi)使學(xué)生得到一個完整的單片機(jī)與嵌入式系統(tǒng)知識體系，為科研實踐提供有力的知識保障。同時，作為實踐性很強(qiáng)的課程教學(xué)，我們利用一切可利用資源用于教學(xué)，將教師科研成果引入教學(xué)，通過具體科研項目案例強(qiáng)化學(xué)習(xí)內(nèi)容的工程觀念；利用課外學(xué)時增加課程設(shè)計內(nèi)容，采用項目導(dǎo)向式教學(xué)方法，實現(xiàn)了交流互動，資源共享，共同進(jìn)步的教學(xué)目標(biāo)；利用各類電子學(xué)科競賽和開放實驗室，使單片機(jī)科研實踐貫穿于整個人才培養(yǎng)階段，在具體科研實踐中使學(xué)生獲得更多更豐富的專業(yè)知識，進(jìn)行科研能力的培養(yǎng)，實現(xiàn)了全階段立體式創(chuàng)新人才培養(yǎng)。

[參考文獻(xiàn)]

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[4]吳磊，嵌入式教學(xué)與實驗的研究，實驗室研究與探索，V0L.30，N0.11，NOV.，2011。

[5]李秀娟，張曉東，魯可，張杰，“嵌入式系統(tǒng)"開放實驗室建設(shè)與實踐，實驗室研究與探索，VOL.3O，NO.5，May，2011。

篇3

【關(guān)鍵詞】白芍總苷；臨床應(yīng)用；制劑；研究進(jìn)展

【中圖分類號】G446 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1004—7484（2013）11—0100—01

白芍總苷（total glucosides of paeonia，TGP）是從中藥白芍（Paeonia lactiflora pall）飲片提取的總苷，是白芍中具有生理功效成分的混合物，其中芍藥苷的含量占總苷的90% 以上。以白芍提取的有效成分芍藥苷為主要成分的帕夫林，已作為第一個治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的抗炎免疫調(diào)節(jié)中藥應(yīng)用于臨床，療效顯著[1]。至今，TGP的研究和應(yīng)用絕大多數(shù)集中在治療風(fēng)濕免疫疾病及調(diào)節(jié)免疫功能方面，但最近也有TGP在心血管、皮膚等病變方面的治療與研究報道，本文綜述了TGP近年來在此方面的研究與應(yīng)用，旨為相關(guān)疾病的治療提供依據(jù)。

1 治療慢性蕁麻疹

鄒氏以白芍總苷聯(lián)合依匹斯汀治療慢性蕁麻疹三組共60例，有效率90%，且不良反應(yīng)少[2]。孟氏以白芍總苷聯(lián)合咪唑斯汀治療慢性蕁麻疹40例，有效率90%，療效明顯好于對照組[3]，盛氏以地氯雷他定聯(lián)合白芍總苷治療慢性蕁麻疹30例，結(jié)果治療組的療效（60%）顯著好于對照組（33.3%），且無明顯不良反應(yīng)[4]。任氏檢測給予白芍總苷治療的慢性蕁麻疹患者（30例）治療前后血清IFN-γ、IL-4、IL-17水平，結(jié)果治療后患者血清IL-4、IL-17的濃度較治療前顯著降低（P

2 治療銀屑病

孫氏以白芍總苷聯(lián)合一清膠囊治療尋常型銀屑病56例，有效率89.3%，顯著高于對照組（P

3 治療散發(fā)型白癜風(fēng)

葉氏以白芍總苷聯(lián)合吡美莫司治療散發(fā)型白癜風(fēng)45例，結(jié)果白芍總苷聯(lián)合吡美莫司能促進(jìn)散發(fā)型白癜風(fēng)患者皮損恢復(fù)，改善外周血CD4+/CD8+T細(xì)胞比值，提高CD4+/CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平[8]。

4 治療干燥綜合征

蔡氏以白芍總苷聯(lián)合甲氨蝶呤治療干燥綜合征60例，治療組有效率83.3%，與對照組差異顯著（P

5 治療附睪淤積癥

陳氏用微波聯(lián)合白芍總苷治療附睪淤積癥27例，總有效率92.59%，表明微波聯(lián)合白芍總苷是治療附睪淤積癥的一種有效方法[10]。

6 治療慢性腎炎蛋白尿

謝氏以白芍總苷聯(lián)合氯沙坦甲治療慢性腎炎蛋白尿33例，結(jié)果治療前后尿蛋白定量明顯下降，治療組較對照組下降的更顯著（P

7 對心肌重構(gòu)的影響

韓氏研究白芍總苷對鹽酸異丙腎上腺素、左旋甲狀腺素誘導(dǎo)所致的心肌重構(gòu)的影響，結(jié)果表明白芍總苷具有一定的抗心肌重構(gòu)作用[12]。

8 治療掌跖膿皰病

賈氏以阿維A聯(lián)合白芍總苷治療掌跖膿皰病30例，結(jié)果有效率87%，明顯高于對照組（68%），差異顯著（P

9 脂質(zhì)體和注射制劑實驗研究

李氏以逆向蒸發(fā)法研究制備了白芍總苷的脂質(zhì)體制劑，獲得了平均粒徑為498nm的圓球狀單室脂質(zhì)體，在4℃貯存穩(wěn)定[14]。劉氏采用柱層析分離、純化，制得純度較高的白芍總苷，通過單因素、正交試驗選出提取溶媒，考察成型工藝，制成注射用白芍總苷凍干粉[15]。

總之，白芍總苷的臨床應(yīng)用與劑型拓展，擴(kuò)大了中藥白芍的應(yīng)用領(lǐng)域。隨著應(yīng)用與研究的深入，白芍將更好地為人類健康作貢獻(xiàn)。

參考文獻(xiàn)：

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篇4

關(guān)鍵詞：原子力顯微鏡 探針 RNA聚合酶 分子間相互作用

一、原子力顯微鏡（AFM）簡介

原子力顯微鏡（AFM）有兩種類型：接觸式和非接觸式，分別基于排斥作用和吸引作用。原子力顯微鏡（AFM）試驗中，探針尖端近似為顯微球，則針尖與樣品表面間的作用力為：F（Z）=2πR0B/3Z3其中Z為針尖與樣品之間的距離，R0為近似顯微球針尖的半徑，B為一個與物體介電常數(shù)有特殊關(guān)系的常量。原子力顯微鏡（AFM）探針安裝在一個靈活的懸臂上，激光二極管發(fā)出的一束激光經(jīng)懸臂反射后，打在一個分裂式光電二極管上，當(dāng)探針在樣品表面掃描時，由于樣品表面原子結(jié)構(gòu)起伏不平，懸臂也就隨之起伏，于是激光束的反射也就起伏。光電二極管將其接收、放大，即可獲得樣品表面凹凸信息的原子結(jié)構(gòu)圖像。原子量級的表面形態(tài)記錄是原子力顯微鏡（AFM）特有的性能。

二、原子力顯微鏡（AFM）的技術(shù)特點

原子力顯微鏡（AFM）本身的優(yōu)勢是其在生物學(xué)中得以迅速發(fā)展的主要原因。首先，原子力顯微鏡（AFM）技術(shù)的樣品制備簡單，無需對樣品進(jìn)行特殊處理，因此，其破壞性較其它生物學(xué)常用技術(shù)（如電子顯微鏡）要小得多；第二，原子力顯微鏡（AFM）能在多種環(huán)境（包括空氣、液體和真空）中運(yùn)作，生物分子可在生理條件下直接成像，也可對活細(xì)胞進(jìn)行實時動態(tài)觀察；第三，原子力顯微鏡（AFM）能提供生物分子和生物表面的分子/亞分子分辨率的三維圖像；第四，原子力顯微鏡（AFM）能以納米尺度的分辨率觀察局部的電荷密度和物理特性，測量分子間（如受體和配體）的相互作用力；第五，原子力顯微鏡（AFM）能對單個生物分子進(jìn)行操縱；另外，由原子力顯微鏡（AFM）獲得的信息還能與其它的分析技術(shù)和顯微鏡技術(shù)互補(bǔ)。

原子力顯微鏡（AFM）還具有對標(biāo)本的分子或原子進(jìn)行加工的能力，例如，可搬移原子，切割染色體，在細(xì)胞膜上打孔等等。綜上所述，原子級的高分辨率、觀察活的生命樣品和加工樣品的力行為成就了原子力顯微鏡的三大特點。

三、使用原子力顯微鏡（AFM）研究生化過程

原子力顯微鏡（AFM）能對轉(zhuǎn)錄的過程進(jìn)行實時觀察，在加入核苷酸后，沉積到云母上的延長復(fù)合物沿著DNA模板單向移動。兩個對照實驗證實RNAP與DNA的相對移動與轉(zhuǎn)錄的實際情況相符。通過PAGE對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果顯示與云母結(jié)合的復(fù)合物具有活性，而且轉(zhuǎn)錄的速度與用原子力顯微鏡（AFM）測得的近似生物分子的構(gòu)象改變也是原子力顯微鏡（AFM）的重要觀察內(nèi)容。將尿素酶沉積到云母上并用原子力顯微鏡（AFM）掃描，在液池中加入尿素后發(fā)現(xiàn)，懸臂的垂直波動明顯增加，這提示由酶活動引起的構(gòu)象改變能直接通過原子力顯微鏡（AFM）記錄下來。

原子力顯微鏡（AFM）在研究分子識別中的應(yīng)用分子間的相互作用在生物學(xué)領(lǐng)域中相當(dāng)普遍，例如受體和配體的結(jié)合，抗原和抗體的結(jié)合，信息傳遞分子間的結(jié)合等，是生物體中信息傳遞的基礎(chǔ)。原子力顯微鏡（AFM）可作為一種力傳感器來研究分子間的相互作用。生物素（biotin）和抗生物素蛋白鏈菌素（streptavidin）間有高親和力，其相互作用的熱力學(xué)數(shù)據(jù)也較為清楚。因而，生物素和抗生物素蛋白鏈菌素是原子力顯微鏡（AFM）測定特異相互作用力的良好典型。

原子力顯微鏡（AFM）在物質(zhì)超微結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用： 原子力顯微鏡（AFM）可以直接觀察到表面缺陷、表面重構(gòu)、 表面吸附體的形態(tài)和位置、以及有表面吸附體引起的表面重構(gòu)等。原子力顯微鏡（AFM）可以觀察許多不同材料的原子級平坦結(jié)構(gòu)，例如，可以用原子力顯微鏡（AFM）對DL-亮氨酸晶體進(jìn)行研究，可觀察到表面晶體分子的有序排列，其晶格間距與X射線衍射數(shù)據(jù)相符。已有文獻(xiàn)報道了關(guān)于采用原子力顯微鏡（AFM）對APA薄膜的表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究的內(nèi)容，發(fā)現(xiàn)了APA表面的特殊結(jié)構(gòu)，從而揭示了APA表面超微結(jié)構(gòu)對半滲透性的重要意義。目前，利用原子力顯微鏡（AFM）已獲得了DNA、透析薄膜、烷烴分子、脂肪酸薄膜以及多糖等的超微結(jié)構(gòu)的圖象。

四、原子力顯微鏡（AFM）在細(xì)胞檢測的應(yīng)用

應(yīng)用原子力顯微鏡（AFM）可研究活細(xì)胞或固定細(xì)胞如紅細(xì)胞、白細(xì)胞、細(xì)菌、血小板、心肌細(xì)胞、活腎上皮細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的動態(tài)行為。原子力顯微鏡（AFM）對體外動態(tài)細(xì)胞的分析具有非凡的能力。這些研究大都把樣品直接放置在玻片上，不需要染色和固定，樣品制備和操作環(huán)境相當(dāng)簡單。用免疫膠體金標(biāo)記細(xì)胞膜則打開了細(xì)胞表面抗原高分辨定位之門。原子力顯微鏡（AFM）細(xì)胞成像如：用原子力顯微鏡（AFM）研究活腎上皮細(xì)胞，可在漿膜小斑上以50nm的分辨率觀察細(xì)胞骨架元素、漿膜淺凹和膜結(jié)合絲。用原子力顯微鏡（AFM）觀察血小板的運(yùn)動，可看到微絲結(jié)構(gòu)、顆粒傳輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)外側(cè)及活化中細(xì)胞成份的再分配。游走上皮細(xì)胞的漿膜可用原子力顯微鏡（AFM）實時成像。

五、應(yīng)用前景

原子力顯微鏡（AFM）現(xiàn)已成為一種獲得樣品表面結(jié)構(gòu)高分辨率圖像的有力工具。而更為吸引人的是其觀察生化反應(yīng)過程及生物分子構(gòu)象變化的能力。因此，原子力顯微鏡（AFM）在生物學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用前景毋庸置疑。而對于原子力顯微鏡（AFM）技術(shù)本身，以下幾個方面的進(jìn)展將更加有利于它在生物學(xué)中的應(yīng)用。大多數(shù)生物反應(yīng)過程相當(dāng)快速，原子力顯微鏡（AFM）時間分辨率的提高有助于這些過程的觀察。高分辨率是原子力顯微鏡的優(yōu)勢。其分辨率在理論上能達(dá)到原子水平，但目前還沒有實現(xiàn)，如何作出更細(xì)的針尖將有助于其分辨率的進(jìn)一步提高。而隨著樣品制備技術(shù)的完善，原子力顯微鏡（AFM）必將成為生物學(xué)領(lǐng)域中一種常規(guī)的研究工具。

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篇5

【關(guān)鍵詞】 伸指肌腱損傷； 縫合技術(shù)； 防止粘連； 研究進(jìn)展

Abstract：The extensor tendon rupture is a common disease.Traditional management includes "8" suture and cross suture.But second operation is commonly needed for the reason of postoperative Nodules or adhesion.So a new technique is invented by the author:micro-weave suture combined with sodium hyaluronate.The new technique has improved dynamic intensity of the tendon and avoided postoperative adhesion.In this paper，this technique is reviewed.

Key words：extensor tendon injury;

suture;

adhesion prevent;

study advancement

伸指肌腱無腱鞘，具有腱周組織，位于手背側(cè)的疏松皮下組織中，故伸指肌腱損傷在手外科中極為常見，斷裂后均主張Ⅰ期修復(fù)，目的是重建最高強(qiáng)度的連續(xù)性、防止粘連、避免2次手術(shù)松解。目前伸指肌腱損傷斷裂的手術(shù)治療主要采用傳統(tǒng)的8字縫合、十字縫合等，但伸指肌腱外形扁，術(shù)中難以縫合，勉強(qiáng)縫合后難免發(fā)生結(jié)節(jié)樣隆起，影響外觀和肌腱滑動，并且強(qiáng)度不夠、易粘連、需2次手術(shù)松解。隨著顯微外科的迅速發(fā)展，我國學(xué)者在肌腱的修復(fù)方面，尤其是屈指肌腱的修復(fù)上做了大量的工作，發(fā)明和改進(jìn)了很多肌腱縫合的方法，但關(guān)于伸指肌腱損傷的研究很少。近年來多提倡采用肌腱顯微外科縫合方法，目的是盡量減少對肌腱血供的影響，有利于肌腱愈合。肌腱損傷手術(shù)后的粘連是手外科的難點，為此國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了一系列的研究，本文就伸指肌腱損傷后的治療進(jìn)展綜述如下：

1

伸指肌腱損傷后的手術(shù)修復(fù)方法

在伸指肌腱損傷修復(fù)中，外科的縫合法是十分重要的，通過手術(shù)重建達(dá)到伸肌腱平衡、穩(wěn)定的效果。目前常用的外科縫合方法有以下4種［1］:第1種為間斷縫合，與肌腱膠原纖維相平行縫合幾針，方法較為簡單，由于伸指肌腱外形扁平且位于皮下，術(shù)中縫合時容易撕脫，勉強(qiáng)縫合后難免發(fā)生結(jié)節(jié)樣隆起，影響美觀和肌腱滑動。從生物力學(xué)方面考慮，肌腱拉伸載荷直接作用于相對的兩端。不能為伸肌腱提供足夠的強(qiáng)度，承受主動活動。第2種縫合，沿肌腱膠原纖維方向作橫向和平行的縫合，其作用肌腱上的拉伸載荷不僅在肌腱末端產(chǎn)生拉伸載荷，同時也產(chǎn)生一些壓縮載荷; 術(shù)后也難免發(fā)生結(jié)節(jié)樣隆起，影響美觀和肌腱滑動。第3種Bunnell縫合，相對于膠原纖維方向作橫向和斜向縫合，其作用在肌腱上的拉伸載荷在肌腱兩端同時產(chǎn)生壓縮和拉伸載荷。能為伸肌腱提供足夠的強(qiáng)度，承受主動活動。第4種為魚嘴或末端編織法，縫合與膠原纖維垂直，其肌腱拉伸載荷在兩個縫合處產(chǎn)生剪切和壓縮載荷，其中壓縮載荷更有利縫合后的肌腱的受力平衡，為伸肌腱提供足夠的強(qiáng)度，符合生物力學(xué)原理。Bunnell、Kessler法修復(fù)后立即產(chǎn)生的縫合強(qiáng)度僅是末端紡織法的60%，而間斷縫合法提供的縫合強(qiáng)度僅是末端紡織法的25%［1］。權(quán)鐵剛等［2］通過實驗認(rèn)為臨床肌腱外科修復(fù)采用末端紡織法為宜，其修復(fù)后具有較好的抗拉伸能力，有利于肌腱的重建。許晨光等［3］應(yīng)用游離肌筋膜移植包埋肌腱縫接處，修復(fù)鞘管區(qū)以外及鞘管區(qū)術(shù)中不能切取完整腱鞘的手部伸肌腱損傷20例(22根肌腱)，均獲成功，并經(jīng)臨床觀察有防止粘連的作用。劉延平［4］采用8字縫合法修復(fù)伸指肌腱損傷85例，療效較好。吳海河等［5］采用端側(cè)對合縫合法治療伸指肌腱斷裂120例共337根肌腱，經(jīng)臨床觀察，療效滿意。賈全章等［6］采用交指樣顯微編織縫合術(shù)加玻璃酸鈉防粘連治療手伸指肌腱斷裂、松弛或缺損，經(jīng)116例臨床應(yīng)用，術(shù)后隨訪2～5年，結(jié)果術(shù)后功能良好，獲滿意效果。羅志強(qiáng)等［7］采用卡鎖環(huán)肌腱縫合法修復(fù)伸指肌腱損傷，以改良Kessler法作為參照，證實卡鎖環(huán)法抗拉力作用顯著，適合于伸指肌腱的修復(fù)。

2

伸指肌腱損傷修復(fù)后的防粘連技術(shù)

臨床上用許多方法來減少肌腱愈合后的粘連：手術(shù)中的無創(chuàng)傷性操作，術(shù)中的嚴(yán)格止血、術(shù)后的合理功能鍛煉等，對于防止肌腱修復(fù)后的粘連起到了一定作用［8］。肌腱的營養(yǎng)與粘連關(guān)系極為密切，肌腱缺血對粘連的形成是一種刺激因素［9］。時志斌等［10］通過研究中藥舒筋湯對家兔肌腱損傷術(shù)后粘連的防治作用后認(rèn)為舒筋湯能有效減輕肌腱損傷術(shù)后粘連，且不影響愈合。目前國內(nèi)外學(xué)者倍加推崇的材料是高分子生物屏障材料。它一方面通過其屏障作用防止或減輕粘連，另一方面通過藥物的藥理作用影響肌腱愈合的內(nèi)源性和外源性機(jī)制(主要加速內(nèi)源性愈合)，達(dá)到減輕粘連的目的［11］。目前所用的有：乳酸、透明質(zhì)酸、5-氟尿嘧啶(5-FU)等，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床的是玻璃酸衍生物，如：玻璃酸鈉(sodium hyaluronate，SH)，玻璃酸衍生物形成的大分子網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可形成一屏障，將細(xì)胞排斥在外，使到達(dá)傷口部位的細(xì)胞明顯減少，由此減少了膠原的成熟和纖維組織的生成［12］。近幾年，實驗研究表明SH有預(yù)防肌腱周圍粘連、營養(yǎng)和、促進(jìn)肌腱愈合的作用，也有持不同觀點，其分歧在于SH的分子量。Tuncay等［13］、Momose等［14］分別用動物實驗證明了應(yīng)用透明質(zhì)酸進(jìn)行鞘內(nèi)注射或局部置入，不僅對肌腱有營養(yǎng)作用，也具有作用，其防止肌腱粘連的作用是肯定的，但是透明質(zhì)酸的作用效果與其分子質(zhì)量、濃度、用量等因素密切相關(guān)，分子質(zhì)量越大，其物理阻隔作用和作用就越強(qiáng)。同時術(shù)中應(yīng)嚴(yán)格縫合腱周膜防止透明質(zhì)酸鈉外漏［15］。漏德寶［16］以雞爪為動物模型比較不同分子質(zhì)量透明質(zhì)酸鈉(SHP)防止肌腱粘連的作用，證實分子質(zhì)量>100萬u的SHP具有防止粘連的作用，分子質(zhì)量為50萬u的SHP和生理鹽水作用相似，不具有防止粘連的作用。王希等［17］選用分子量在150～250萬的SH，總體效果更為顯著，且作用持久。其效果可能是HS的高黏彈性、滲透性、生物相容性的理化和流變學(xué)特性及生物學(xué)活性的特點，產(chǎn)生以下作用：(1)生物屏障作用：增加，減少摩擦力，緩沖應(yīng)力，降低滑膜的通透性，減輕肌腱的水腫；(2)預(yù)防粘連作用：抑制成纖維細(xì)胞的生長，減少膠原纖維的合成，預(yù)防肌腱的粘連和變性；(3)止痛作用：覆蓋和保護(hù)痛覺感受器，與疼痛介質(zhì)相結(jié)合，緩解疼痛［18］。王呈等［19］通過動物實驗證實了酰肼交聯(lián)玻璃酸鈉膜生物相容性好，在體內(nèi)存留時間長，能夠產(chǎn)生比較理想的防粘連作用。程敏等［20］對39例手外傷共46條伸指肌腱損傷患者采用玻璃酸鈉腱周局部注射預(yù)防術(shù)后粘連，優(yōu)良率達(dá)89. 1%，其療效顯著。朱興仁［21］將玻璃酸鈉用于手外科手術(shù)預(yù)防術(shù)后關(guān)節(jié)、肌腱、神經(jīng)粘連，取得滿意效果。Klein等［22］認(rèn)為乳酸鹽在肌腱損傷時能刺激肌腱細(xì)胞增殖和膠原合成，有利于肌腱早期愈合。Cerovac等［23］術(shù)中將5-FU涂于肌腱損傷區(qū)與生理鹽水組對照，結(jié)果前者的肌腱粘連發(fā)生率明顯小于后者。幾丁糖薄膜是一種通透性好、柔軟、易溶解和稀釋，在體內(nèi)可緩慢降解的生物膜，并具有獨特的選擇性抑制成纖維細(xì)胞及抑制細(xì)菌生長的生物活性，將其作為一種預(yù)防肌腱粘連的生物材料具有較好的效果［24］。Df-521(東菱迪芙、巴曲酶)可以促進(jìn)纖維蛋白溶解酶形成，抑制血液中纖維蛋白凝集在肌腱周圍，局部應(yīng)用被證明有良好的防肌腱粘連的作用［25］。

保護(hù)下的盡早正規(guī)、系統(tǒng)的功能康復(fù)訓(xùn)練有確切的防肌腱粘連的作用。術(shù)后早期功能鍛煉可減輕粘連，可能與在壓應(yīng)力作用下血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)下降、肉芽組織形成減少、外源性愈合受到抑制有關(guān)［26］。早期控制下活動，既要使修復(fù)肌腱在適當(dāng)應(yīng)力下滑動，又要把肌腱縫合口的應(yīng)力控制在安全范圍內(nèi)，避免肌腱斷裂或間隙形成［27］。賈全章等［28］采用交指樣編織縫合法配合玻璃酸鈉應(yīng)用治療手伸指肌腱損傷，并于術(shù)后傷口換藥時或者間隔5～7 d被動屈伸活動患指2～4次，可防止肌腱粘連形成。早期活動可機(jī)械性阻斷肌腱與周圍組織的接觸，減少外源細(xì)胞長入肌腱，而應(yīng)力作用促進(jìn)了肌腱本身腱外膜細(xì)胞的分化，抑制炎性細(xì)胞浸潤，促進(jìn)膠原纖維平行排列于肌腱縱軸，有利于重建肌腱功能。

綜上所述，筆者認(rèn)為伸指肌腱損傷后的治療需要一個系統(tǒng)的治療方案，即：手術(shù)采用顯微外科無創(chuàng)技術(shù)、保護(hù)腱周組織和滑膜；編織縫合法增強(qiáng)抗拉力，以重建肌腱最高強(qiáng)度的連續(xù)性；玻璃酸鈉防止粘連，避免2次手術(shù)松解；術(shù)后早期保護(hù)性的主動和被動活動及中后期功能鍛煉。上述的交指樣顯微編織縫合法不僅能為伸肌腱提供足夠的強(qiáng)度，并且其縫合點分散，基本保持腱扁平外形，術(shù)后外形良好，不影響活動；玻璃酸鈉亦被臨床證明能有效的防止肌腱粘連，所以說采用交指樣顯微編織縫合術(shù)加玻璃酸鈉是目前治療伸指肌腱損傷系統(tǒng)、完整和科學(xué)的治療方法。

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篇6

【摘要】經(jīng)皮椎體成形術(shù)是近年來發(fā)展起來的脊柱微創(chuàng)手術(shù), 該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于治療骨質(zhì)疏松性椎體骨折及多種良惡性椎體病變,并取得了良好的臨床療效。 本文綜述了其基本概念、適應(yīng)癥與禁忌癥、操作技術(shù)、并發(fā)癥及其防治、成形材料等的研究近況，以及PVP技術(shù)的展望，以期提高對此技術(shù)的認(rèn)識。

【關(guān)鍵詞】椎體成形術(shù)；臨床應(yīng)用；展望

經(jīng)皮椎體成形術(shù)(percutaneous vertebroplasty, PVP)是一種微創(chuàng)技術(shù)，通過向椎體內(nèi)灌注骨水泥來增加椎體強(qiáng)度和穩(wěn)定性，迅速減輕椎體壓縮骨折所致疼痛，其治療效果確切。首先應(yīng)用經(jīng)皮椎體內(nèi)注射聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）的方法,成功治療1例長期疼痛的C2椎體海綿狀血管瘤患者。現(xiàn)筆者對這一技術(shù)的臨床應(yīng)用及進(jìn)展作一綜述。

1 PVP的適應(yīng)征與禁忌征

1. 1 適應(yīng)征：PVP主要用于治療各種原因引起的椎體壓縮性骨折、腫瘤浸潤、Kummells病等引起的疼痛。

1. 1. 1 骨質(zhì)疏松性椎體骨折 脊柱壓縮性骨折是骨質(zhì)疏松癥的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。通過臥床、藥物等保守治療可緩解癥狀，但多數(shù)藥物有副作用，并易發(fā)生椎體高度進(jìn)一步丟失，所以對骨質(zhì)疏松性椎體骨折患者，PVP無疑是一種更好的選擇。Evans等報道488例椎體成形術(shù)，術(shù)后按10級疼痛方法分級，疼痛減輕程度由原來的8.9降至3.4。Mauritsetal回顧性分析了112例骨質(zhì)疏松性椎體骨折患者行PVP治療后的短期、中期及長期療效，幾乎所有的患者均取得了良好的療效。

1. 1. 2 創(chuàng)傷性椎體骨折 隨著新型填充材料的研發(fā)以及PVP應(yīng)用領(lǐng)域的擴(kuò)展，已有PVP治療創(chuàng)傷性脊柱骨折的報道，一般用于神經(jīng)功能完好、后凸畸形

1. 1. 3 椎體腫瘤 PVP最早用于治療椎體血管瘤、骨髓瘤、椎體轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤及原發(fā)惡性腫瘤，效果明顯。骨髓瘤常為多灶性，切除難度大，而放療會削弱骨重建能力并增加患者的痛苦，使椎體塌陷導(dǎo)致神經(jīng)受壓的危險性增加。PVP能立即緩解疼痛、栓塞瘤體并增加脊柱的強(qiáng)度和穩(wěn)定性，若再行后路椎板減壓，這樣既簡化了手術(shù)又無須椎體切除。

1. 2 禁忌征 有凝血功能障礙及不能行急診椎板切除減壓的患者不宜作PVP。相對禁忌證為: 椎體廣泛性骨質(zhì)破壞, 后緣不完整者; 椎體壓縮程度超過75%者; 椎體塌陷或腫瘤擴(kuò)散致硬膜囊及神經(jīng)根壓迫者; 成骨性轉(zhuǎn)移瘤。

2 PVP操作方法及注意點

手術(shù)采用局部麻醉。在C型臂X線機(jī)透視下行椎體穿刺，穿刺時針尖應(yīng)達(dá)椎體前1/3，針尖的斜面朝向注射的部位，灌注劑呈糊狀時再注射，當(dāng)感到阻力明顯增大或透視發(fā)現(xiàn)骨水泥漏入椎間孔、椎靜脈叢時立即停止，根據(jù)灌注劑在椎體內(nèi)分布情況可一處或多處注射，注入量應(yīng)根據(jù)椎體破壞情況及椎體水平而定，一般每個椎體2～10ml。

3 椎體成形的材料

3. 1 成形材料

3. 1. 1 聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）是PVP最初使用也是最常用的成形材料。該材料最顯著的特點就是止痛效果明顯。各國學(xué)者報道的疼痛緩解率為60% ～100% ,多數(shù)在90%以上。

3. 1. 2 磷酸鈣骨水泥(CPC) CPC主要組成是2種不同的磷酸鈣鹽。它們在一定條件下發(fā)生沉淀反應(yīng)，形成羥基磷灰石結(jié)晶。近期止痛效果明顯，其遠(yuǎn)期療效是否能保持，尚缺乏臨床研究。

3. 1. 3 復(fù)合材料 復(fù)合性骨水泥較單一材料有明顯的改進(jìn)，且有可注射材料配方，如PMMA和CPC的復(fù)合配方，PMMA和(或) CPC與其他一種或幾種生物材料的配方。但是這些配方在PVP的研究中多處于探索階段，尚不能確定是否能用于臨床。

3. 2 負(fù)載材料 根據(jù)不同疾病的治療要求,可在成形材料中添加各種負(fù)載材料，如在成形材料中添加抗生素，可以預(yù)防PVP術(shù)后合并的感染，在PMMA中加入抗炎止痛藥物磷柳酸，可以增加磷灰石的沉積，并能提高其生物相容性。

4 PVP疼痛緩解的可能機(jī)制

PVP有效性的確切機(jī)制尚不明了，他可能包含幾種作用的結(jié)合：聚甲基丙烯酸甲酯改善了骨的負(fù)荷能力，并可能通過直接組織毒性和熱損傷直接干預(yù)了疼痛的傳入；此外在脊柱轉(zhuǎn)移性病例中，PMMA注射（除了對椎體的機(jī)械性穩(wěn)定）可能也導(dǎo)致了腫瘤血供的凝結(jié)以及對腫瘤的直接毒性，因此降低了腫瘤對病椎的破壞。

5 PVP并發(fā)癥及其防治

5. 1 PVP并發(fā)癥 ①骨水泥滲漏是最常見的并發(fā)癥。此種情況多由骨水泥進(jìn)入椎間盤、椎間孔、椎管內(nèi)、椎旁軟組織以及椎靜脈叢，造成神經(jīng)根及脊髓的熱傷和壓迫傷，產(chǎn)生相應(yīng)的癥狀和體征。Chiras等［14］報道274例PVP僅發(fā)生一例（0.3%）因骨水泥滲漏至椎管壓迫脊髓導(dǎo)致截癱，該患者為惡性腫瘤引起的痛性椎體損害，經(jīng)手術(shù)減壓后神經(jīng)癥狀部分恢復(fù)。其次是肺栓塞，Padovanietal報道了1例41歲女性患者在PVP后并發(fā)肺栓塞，胸部X線及CT均證實肺動脈中有骨水泥存在，該患者經(jīng)抗凝治療后效果滿意。②肋骨骨折和神經(jīng)根痛。③鄰椎骨折：Troutetal回顧性分析了432例行PVP治療的患者，認(rèn)為行PVP后，鄰椎發(fā)生骨折的概率較非鄰椎明顯要高。④其它：如猝死、感染等極為罕見。

5. 2 并發(fā)癥的預(yù)防: 提高PVP的安全性的因素是多方面的，如正規(guī)的操作培訓(xùn)、嚴(yán)格把握手術(shù)的適應(yīng)征、熟悉脊柱的解剖結(jié)構(gòu)、穿刺針入路的正確選擇、良好的術(shù)中X線透視、正確的手術(shù)等。

6 PVP技術(shù)的發(fā)展方向

6. 1 探索理想的成形材料 理想的生物材料應(yīng)同時具備以下條件：生物活性、可降解性、相容性好；良好的滲透能力，與病變椎體緊密結(jié)合，迅速而持久地維持椎體的生物力學(xué)性能；寬裕的固化時間和良好的放射顯影。然而到目前為止，還未找到一種真正理想的成形材料。PMMA和CPC雖然都有較好的臨床療效，但都不完全符合理想材料的條件。改進(jìn)的新型復(fù)合性材料可克服單純材料的缺點，有望成為理想的成形材料。

6. 2 探索合適的負(fù)載材料及配方:為滿足不同椎體疾病的治療要求，可選擇負(fù)載材料與成形材料組成不同的配方。而各種負(fù)載材料的選擇、調(diào)配方法、對成形材料的影響、在機(jī)體中的釋放情況以及能否達(dá)到預(yù)期目的，都還有待于進(jìn)一步的研究。

7 脊柱骨折治療的展望

椎間穩(wěn)定結(jié)構(gòu)保持相對完整的脊柱骨折，手術(shù)減壓復(fù)位后，如果理想的灌注材料能立即重建有足夠強(qiáng)度的脊柱，則單純椎體成形術(shù)可望達(dá)到脊柱穩(wěn)定的目的；隨著PVP技術(shù)的進(jìn)步，對某些不需減壓的脊柱骨折，如對于神經(jīng)功能完好、后凸畸形< 20°，椎體壓縮< 50%，脊柱穩(wěn)定或相對穩(wěn)定的新鮮胸腰椎骨折，PVP有望取代外科手術(shù)達(dá)到復(fù)位、固定的效果，這將無疑會是脊柱外科的一場變革。

參考文獻(xiàn)

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篇7

1 細(xì)胞培養(yǎng)的歷史沿革

細(xì)胞生物學(xué)是生命科學(xué)的理論基礎(chǔ)，也是現(xiàn)代生命科學(xué)的前沿科學(xué)，而細(xì)胞培養(yǎng)是其中的重要部分。細(xì)胞培養(yǎng)分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)[2]，目前細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)各個領(lǐng)域，是分子生物學(xué)和實驗室生物技術(shù)等的核心實驗室技術(shù)[3]。細(xì)胞培養(yǎng)始于20世紀(jì)初，1907年，Harrison利用懸滴法將分離自青蛙胚胎的神經(jīng)細(xì)胞種植在青蛙的淋巴液中，首次在體外模擬了細(xì)胞的生長活動，為后來開展體外細(xì)胞研究開辟了新途徑， Harrison也因此被譽(yù)為“細(xì)胞培養(yǎng)之父”[4]。1910年， Burrows在從Harrison實驗室學(xué)習(xí)了這種技術(shù)以后嘗試用雞血漿代替淋巴液培養(yǎng)細(xì)胞并獲成功。此后，Burrows與其外科醫(yī)生出身的同事Alexis Carrel進(jìn)一步致力于哺乳動物組織的培養(yǎng)技術(shù)研究。1912年，Alexis Carrel[4]將外科手術(shù)嚴(yán)格的無菌技術(shù)引入細(xì)胞培養(yǎng)并發(fā)明了專門的細(xì)胞培瓶（Carr-el flask，卡氏培養(yǎng)瓶），顯著改良了Harrison所建立的培養(yǎng)技術(shù)并將其應(yīng)用于成年組織細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)實踐中，由于此研究成果的重大貢獻(xiàn)，1912年，Alexis Carrel被授予諾貝爾醫(yī)學(xué)與生理學(xué)獎，此后Alexis Carrel在體外成功培養(yǎng)了分離自雞胚心臟的心肌細(xì)胞，并將其一直培養(yǎng)到了1946年，證明了體外細(xì)胞不但可以存活而且能傳代增殖。1949年，Alan Parks發(fā)明了-196℃超低溫凍存細(xì)胞的技術(shù)，成為細(xì)胞培養(yǎng)歷史上又一次重大的技術(shù)進(jìn)步。此后，抗生素和胰蛋白酶的出現(xiàn)，也極大地促進(jìn)了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展。1952年，GO Gey[4]成功地培養(yǎng)了人類腫瘤組織并建立至今仍使用的HeLa細(xì)胞系，使細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)展到人類組織培養(yǎng)階段。20世紀(jì)80年代，以眾多細(xì)胞系的建立為特點。現(xiàn)在細(xì)胞培養(yǎng)基本上滲透到到生命科學(xué)的各個領(lǐng)域，隨著培養(yǎng)條件的改善，該技術(shù)也越來越容易掌握。

2 根據(jù)材料和細(xì)胞接觸方式的細(xì)胞毒性評價方法

依據(jù)接觸方式，目前常用的評價口腔醫(yī)療器械細(xì)胞毒性試驗方法有以下三種[5]：瓊脂擴(kuò)散試驗、濾膜擴(kuò)散實驗、直接接觸實驗。①瓊脂擴(kuò)散試驗（間接接觸試驗）：適用于固體（包括粉末）和液體等試驗材料的檢測，通過瓊脂糖擴(kuò)散后來評價材料的非特異性細(xì)胞毒性；②濾膜擴(kuò)散實驗（間接接觸試驗）：適用于固體（包括粉末）和液體等試驗材料的檢測，通過乙酸纖維素濾膜擴(kuò)散后評價材料的非特異性細(xì)胞毒性；③直接接觸實驗（包括浸提液試驗）：該試驗適用于評價固體材料和材料浸提液或液體材料的細(xì)胞毒性。

在應(yīng)用直接接觸試驗時，體外培養(yǎng)的細(xì)胞，失去了身體神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞間相互作用的影響，生活在缺乏動態(tài)平衡的相對穩(wěn)定環(huán)境中，而且其生長受營養(yǎng)條件、生長空間等因素的限制，所以，Hensten 等[6]認(rèn)為，直接接觸法所得的結(jié)果不能反映材料在口腔內(nèi)實際的生物相容性，缺乏準(zhǔn)確性。在間接接觸試驗中，瓊脂擴(kuò)散試驗和濾膜擴(kuò)散實驗利用可溶性抗原與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合，從而來檢測標(biāo)本中各種免疫球蛋白和血清中各種補(bǔ)體成分的含量，敏感性很高。Murray 等[7]研究表明在間接接觸試驗中，瓊脂或者濾膜作為屏障用于模擬口腔黏膜，能較為真實地反映口腔的環(huán)境，但瓊脂類材料和牙本質(zhì)的滲透性還是有很大的區(qū)別[8]，故而間接接觸試驗不能有效地反映牙本質(zhì)情況，目前的標(biāo)準(zhǔn)體外細(xì)胞毒性試驗存在一些不足之處，主要原因是試驗細(xì)胞與試驗材料之間沒有牙本質(zhì)屏障[9]。近年來，國內(nèi)陳志軍等[10]利用人工羥基磷灰石陶瓷片模擬牙本質(zhì)，從而確保牙本質(zhì)通透性的可控性，為口腔材料體外細(xì)胞毒性試驗提供了一個高效可靠的評價方法。

3 生物學(xué)終點評價細(xì)胞毒性的評價形式

生物學(xué)終點評價形式包括以下五種：

3.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)評價：主要是觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，該方法是最早用于檢測細(xì)胞損傷的方法，通過在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的改變，可以判斷細(xì)胞是否有污染、是否健康以及增殖情況。在顯微鏡下，通過觀察裂解細(xì)胞所占的比例來評估細(xì)胞毒性級別，Sujata等[11]研究得出細(xì)胞形態(tài)學(xué)評價方法與MTT法等定量細(xì)胞毒性法的Perason相關(guān)系數(shù)為0.9，表明兩者具有良好的相關(guān)性。目前，該方法仍廣泛用于生物材料細(xì)胞毒性的評價。

3.2細(xì)胞膜性效應(yīng)評價：主要是從細(xì)胞膜的通透性改變方面來鑒別存活細(xì)胞與死亡細(xì)胞，包括以下兩種試驗方法。

3.2.1中性紅攝取試驗（NRU）：1986年，Borenfreund等[12]建立中性紅攝取試驗，并對多種材料細(xì)胞毒性進(jìn)行評價，表明該試驗是快速評價細(xì)胞毒性的方法。國際標(biāo)準(zhǔn)ISO已收錄該檢測方法，經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）也于2010年將該方法列為細(xì)胞毒性試驗預(yù)測急性經(jīng)口毒性試驗起始劑量的指導(dǎo)性文件[13]。

3.2.2乳酸脫氫酶釋放法（LDH 釋放法）：乳酸脫氫酶（LDH）是活細(xì)胞胞漿內(nèi)酶之一，正常情況下，不能透過細(xì)胞膜。當(dāng)細(xì)胞受到損傷時，細(xì)胞膜通透性改變，LDH可釋放至細(xì)胞外，所以培養(yǎng)基中該酶活性與被裂解的細(xì)胞數(shù)量成正比，采用全自動生化分析儀直接檢測細(xì)胞培養(yǎng)板上清液中LDH，可以反映細(xì)胞損傷程度。此方法操作簡便，靈敏度高，用LDH釋放法檢測腫瘤患者CIK細(xì)胞（細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞）活力，有助于CIK療法適應(yīng)患者的選擇及個體療效觀察[14]。

3.3細(xì)胞代謝活性評價：該方法是通過檢測細(xì)胞生物代謝或生物合成功能的改變來了解細(xì)胞損傷作用，當(dāng)前，以活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶作為生物學(xué)終點的評價方法可以靈敏地反映材料對細(xì)胞的損害程度[15]。主要包括MTT實驗和XTT實驗。

3.3.1 MTT試驗：MTT試驗以活細(xì)胞代謝物還原劑3-（4，5）-dimethylthia-hiazo（-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide， MTT噻唑藍(lán)為基礎(chǔ)，通過MTT噻唑藍(lán)作用于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶，生成非水溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，且MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。目前該試驗作為材料細(xì)胞毒性評價方法，實驗步驟規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)果準(zhǔn)確，簡便快速[16-17]，但是在試驗過程的結(jié)晶產(chǎn)物，需要用二甲基亞礬（DMSO）溶解后才能測定光吸收值，若是溶解不充分，會影響測定結(jié)果，從而使得MTT靈敏度略差，因此，楊曉冉等[18]建議MTT法和中性紅攝取試驗（NRU）聯(lián)合使用。

3.3.2 XTT試驗：XTT試驗在MTT的基礎(chǔ)上，省去溶解還原產(chǎn)物結(jié)晶的步驟，1988年，Scudiero等[19]首次采用該方法檢測細(xì)胞增殖。XTT是一種與MTT類似的四唑氮衍生物，可被活細(xì)胞線粒體脫氫酶還原成水溶性的棕色甲肷產(chǎn)物，當(dāng)XTT與電子偶合劑共同使用時，甲肷的生成量與細(xì)胞的增殖程度呈正相關(guān)。該試驗方法較MTT 法具有顯著優(yōu)點，已被納入國際標(biāo)準(zhǔn)ISO10993-5：2009中，但XTT水溶液不穩(wěn)定，需要低溫保存或現(xiàn)配現(xiàn)用，成本較高。

3.4細(xì)胞增殖率評價：主要是觀察材料或材料浸提液與細(xì)胞接觸后細(xì)胞生長速度和增殖的變化，主要有克隆形成試驗。最早由Tuchiya提出，用克隆形成率（實驗組克隆數(shù)/對照組克隆數(shù)）來評價材料的細(xì)胞毒性。Tuchiya等[20]研究表明，克隆形成試驗較分子濾過法、瓊脂覆蓋法、中性紅攝取法更為敏感，目前該方法已收錄在國際標(biāo)準(zhǔn)ISO 10993-5：2009中。

3.5 DNA合成率檢測評價：通過測定有絲分裂的細(xì)胞數(shù)來評價細(xì)胞的增殖能力，主要有5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu）滲入法和胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）滲入法。敏感性很高，但重復(fù)性略差[21]。

綜上所述，評價材料的體細(xì)胞毒性的試驗方法較多，而由于不同材料接觸方式及毒理不一，各試驗方法之間又存在很大的敏感差異。因此，Weyermann等[22]提倡在選擇試驗方法時，必須根據(jù)“最接近應(yīng)用狀況”的原則，合理地選擇樣品與細(xì)胞的接觸方式和檢測生物學(xué)終點的評價方法。

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篇8

肺癌舌象具有一定的規(guī)律特征，據(jù)其特征可以協(xié)助臨床診斷、分期與治療，判斷預(yù)后。舌象分析與實驗分子生物學(xué)研究的結(jié)合從微觀角度闡述了肺癌舌象特征。

關(guān)鍵詞：肺癌；舌診；綜述

【中圖分類號】

R365 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B 【文章編號】1002-3763（2014）07-0036-01

肺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，近年來肺癌的死亡率在我國已躍居第一位。隨著中醫(yī)藥在惡性腫瘤治療中的地位日益提高，具有明顯中醫(yī)特色的舌診在臨床中的地位逐漸突顯。腫瘤界專家學(xué)者對肺癌舌象的研究在結(jié)合現(xiàn)代化技術(shù)的基礎(chǔ)上不僅從臨床診斷、治療等各方面對其進(jìn)行闡述，還在微觀上不斷探索，并且取得了一定的成果進(jìn)展，現(xiàn)綜述如下。

1 中醫(yī)舌診的現(xiàn)代化

早在上世紀(jì)80年代，清華大學(xué)就開始與西苑醫(yī)院合作研發(fā) “中醫(yī)舌診自動識別系統(tǒng)”，本系統(tǒng)確定了某些舌象的定義閾，建立了中醫(yī)數(shù)字舌圖的初步標(biāo)準(zhǔn) [2] 。本世紀(jì)初，眾多專家[3]開始嘗試使用客觀定量指標(biāo)來描述舌象特征。計算機(jī)技術(shù)的應(yīng)用將中醫(yī)診斷的客觀量化引入一個新的領(lǐng)域，為中醫(yī)舌診今后的深入研究提供了一個新的思路和方向。

2 肺癌的舌象特征

舌象是中醫(yī)辨證論治、判斷疾病預(yù)后和轉(zhuǎn)歸的客觀依據(jù)之一，因此，人們也分別從舌質(zhì)、舌苔、舌形等多方面對肺癌的舌象進(jìn)行了觀察研究。

2.1 肺癌的舌質(zhì)特征：

張倫等[5]采用比色板法分析433例肺癌患者的舌質(zhì)發(fā)現(xiàn)紫暗舌比重極高，陳群等[6]觀察發(fā)現(xiàn)舌下絡(luò)脈曲張是肺癌患者出現(xiàn)最多的瘀血舌象，其次為紫暗舌，瘀斑瘀點出現(xiàn)率最少，馮月娟等[11]對112例肺癌患者舌象觀察發(fā)現(xiàn)紫暗舌的出現(xiàn)率最高，腺癌以紫暗舌、紅絳舌為主，而小細(xì)胞癌、鱗癌則以紫暗舌為主。

2.2 肺癌的舌形特征：

張倫等[5]觀察433例肺癌舌象發(fā)現(xiàn)前三位的異常舌形分別為裂紋舌（18.2%）、齒痕舌（10.8%）、胖大舌（8.1%）。杜堅[7]觀察115例癌癥患者以及280例體檢正常者的舌象結(jié)果顯示癌癥患者異常舌形出現(xiàn)率相對較高，占52.2%，而異常舌形中以齒印舌和胖大舌為多，各占15.7%和13%。馮月娟等[11]發(fā)現(xiàn)鱗癌與小細(xì)胞癌以胖大舌和齒印舌為多，其次為裂紋舌；而腺癌裂紋舌比例較高。吳君德[8] 對250例常見腫瘤的觀察也發(fā)現(xiàn)裂紋舌在肺癌中所占比例較多，約30.77%。

2.3 肺癌的舌苔特征：

舌苔是分析病因病機(jī)的重要舌象組成部分。張倫等[5]觀察分析肺癌患者舌象發(fā)現(xiàn)厚膩苔比例極高，而從苔色方面黃苔和白苔無顯著差異。結(jié)果表明肺癌患者痰濕濁邪相對較重。馮月娟等[11]的觀察結(jié)果還顯示鱗癌與小細(xì)胞癌的舌苔以膩苔為主；腺癌以薄白苔、光剝苔為主。

3 肺癌舌象的臨床應(yīng)用

3.1 協(xié)助診斷、分期，判斷預(yù)后：

“舌為五臟六腑之外候”，因此，觀察其舌象變化，可以輔助診斷，判斷預(yù)后。

3.2 協(xié)助治療：

舌診在惡性腫瘤中醫(yī)辨證施治上具有不可替代的作用，眾多醫(yī)家學(xué)者都在肺癌治療中通過觀察舌象特征辯證分型，采取相應(yīng)的治法，大多取得了較理想的臨床療效。

基于腫瘤患者在放、化療前后舌象的明顯變化，我們可以判斷患者對放化療的耐受程度，并據(jù)其指導(dǎo)放化療劑量，避免大劑量物理或化學(xué)治療對患者正氣的損傷。陳健民等[15]的研究發(fā)現(xiàn)：對于放療，淡白舌患者對射線的“熱毒”有較大耐受性，大多可以順利完成根治劑量的治療；相反，考慮到“熱上加熱”，對于肺癌紅絳舌的患者應(yīng)該從小劑量開始放療，同時配合清熱解毒、養(yǎng)陰生津類中藥；對于化療，淡白舌的患者具有療效不理想且消化道反應(yīng)及骨髓抑制等不良反應(yīng)較多的特點，化療屬于“以毒攻毒”，對于的正虛寒凝的淡白舌患者犯了虛虛之戒，因此對于淡白舌的肺癌患者應(yīng)在放療之前使用益氣養(yǎng)血、健脾益腎類中藥。孫韜[16]的研究結(jié)果顯示肺癌患者化療后瘀血舌象明顯增加，而薄黃苔、黃膩苔或白膩苔且顯著減少，這說明化療會加重血瘀證候，減輕痰熱及痰濕證，因此通過肺癌患者的舌象變化來干預(yù)指導(dǎo)化療的劑量可以減少“虛者更虛，瘀者更瘀”的發(fā)生，從而提高患者耐受性。

4 舌象的微觀研究

4.1 舌象與凝血的研究：

為進(jìn)一步探討肺癌患者瘀血舌象的病理生理基礎(chǔ)， 陳群等[17]的研究中發(fā)現(xiàn)，肺癌患者瘀血舌象的出現(xiàn)與其血漿前列環(huán)素（PGI 2） 和血栓烷A2（TXA2）水平具有相關(guān)性。路艷、陳群的觀察結(jié)果顯示與非瘀血組相比，肺癌瘀血舌象組PAI-1顯著升高，腫瘤轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組相比，其PAI-1也顯著升高?；谝陨辖Y(jié)果，我們考慮纖溶系統(tǒng)的變化可能是肺癌瘀血舌象與腫瘤轉(zhuǎn)移之間的一種微觀聯(lián)系[18]。

4.2 舌象與EGFR的研究：

肖寒、申小蘇等[19]測定103例肺癌患者的觀察發(fā)現(xiàn)：氣血瘀滯證、黯舌、膩苔的患者血清中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）值明顯高于氣虛痰濕證、陰虛熱毒證、氣陰兩虛證的患者。本研究提示提示氣血瘀滯證、黯舌、膩苔的患者VEGF值相對較高，其血管生成旺盛，腫瘤易于發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此中在辨證論治的基礎(chǔ)上酌加活血化瘀的藥物，對于降低VEGF值、預(yù)防轉(zhuǎn)移或許存在一定作用。

4.3 舌象與T細(xì)胞亞群的相關(guān)研究：

路艷、陳群等[20]觀察30例肺癌舌象發(fā)現(xiàn)：與非瘀血舌象組相比，肺癌瘀血舌象組CD4/CD8明顯降低，NKC值明顯升高，且均具有統(tǒng)計學(xué)差異。

5 問題與展望

以上研究顯示肺癌患者的舌象具有明顯的規(guī)律特征，這為中醫(yī)舌診在肺癌預(yù)防和診治中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。但是舌診主觀性較強(qiáng)，在查舌方法以及標(biāo)準(zhǔn)上存在較大的差異，所以我們需要在辨證理論指導(dǎo)下，通過數(shù)字舌象、微機(jī)定量分析等先進(jìn)的科學(xué)技術(shù)綜合分析 [21-22]，使中醫(yī)舌診更具有科學(xué)依據(jù)。然而先進(jìn)科學(xué)技術(shù)在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)的普及率較低，故如何將舌診規(guī)范化、客觀化，將成為今后腫瘤舌象研究的重點。

參考文獻(xiàn)

[1] 余興龍，竺子明，金國藩，等.中醫(yī)舌診自動識別系統(tǒng)[J].儀器儀表學(xué)報，1994

篇9

[關(guān)鍵詞] HAAM；BMSCs；軟骨細(xì)胞；PI3K/MAPK

[中圖分類號] R363 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）18-0031-04

Evaluation of acellular amniotic membrane loaded stem cells in repairing and optimizing cartilage injury by PI3K / MAPK pathway

ZHANG Zhijin1 ZENG Linru1 ZHU Fangbing1 GUO Lin2 LI Qianxiao3

1.Department of Orthopaedics， Xiaoshan District Traditional Chinese Medicine Hospital of Hangzhou City， Hangzhou 311201， China； 2.Department of Joint Surgery， Zhongshan Hospital Affiliated to Dalian University， Dalian 116000， China； 3.Department of Cardiology， Hangzhou Red Cross Hospital， Hangzhou 310000， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of human acellular amniotic membrane （HAAM） loaded stem cells in repairing and optimizing cartilage injury by PI3K/MAPK pathway. Methods Bone mesenchymal stem cells （BMSCs） were isolated from New Zealand white rabbits and were plated on HAAM combined with chondrocytes at 4：1. The repair and optimization of chondrocytes were observed at 7 and 14 days after inoculation. The survival rate of chondrocytes was detected by cell count CCK-8 method. The apoptosis of chondrocytes was detected by TUNEL method. Western Blot was used to detect the expression of type Ⅰcollagen， type Ⅱ collagen， expression levels of phosphorylated protein p-PKC， p-p38， p-JNK and p-ERK. Results Compared with that in the control group， the survival rate of the experimental group was significantly higher， and cell apoptosis of the experimental group was significantly reduced， and the difference was statistically significant（P

[Key words] HAAM； BMSCs； Chondrocytes； PI3K/MAPK

炎癥、衰老、創(chuàng)傷和其他各種疾病與骨性關(guān)節(jié)炎及關(guān)節(jié)軟骨損傷的發(fā)生密切相關(guān)。抑制軟骨細(xì)胞降解，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的生長可明顯延緩和優(yōu)化軟骨損傷[1，2]。軟骨細(xì)胞是骨性損傷的主要靶細(xì)胞，各種生化因素和機(jī)械因素作用于軟骨細(xì)胞，可刺激軟骨細(xì)胞分泌細(xì)胞因子、軟骨變性蛋白酶、各種炎性介質(zhì)，它們可使軟骨變性[3，4]。而骨性關(guān)節(jié)軟骨的自我修復(fù)能力很差，如何刺激軟骨細(xì)胞分泌膠原，改善軟骨損傷是臨床骨科面臨的重要問題之一。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是一類具有多項分化潛能的細(xì)胞，來源豐富容易分離培養(yǎng)，已成為骨組織工程研究中的最佳種子細(xì)胞[5]。人羊膜衍生膜（human acellular amniotic membrane，HAAM）是一種從細(xì)胞滋養(yǎng)層衍化而來的半透明的薄膜，羊膜基底膜上含有多種膠原蛋白、糖蛋白和蛋白多糖等成分，可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化和組織修復(fù)[6-8]。本研究主要利用組織工程技術(shù)將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞種植于HAAM上，觀察軟骨細(xì)胞在HAAM上的生長增殖情況，為修復(fù)和優(yōu)化軟骨損傷的進(jìn)一步研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般材料

一抗多克隆抗體Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原；p-p38、p-JNK、p-ERK、p-PKC、ACTB購于美國SantaCruz生物技術(shù)有限公司；二抗堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；Western Blot電泳儀（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及其處理 2只1月齡新西蘭白兔，雌雄不限，BMSCs與軟骨細(xì)胞按4∶1接種于HAAM上，調(diào)整總細(xì)胞終濃度為5.0×107/mL，隨機(jī)分為以下各組：A組為HAAM-BMSCs-軟骨細(xì)胞組（其中BMSCs：軟骨細(xì)胞=4∶1，實驗組）、B組為BMSCs-軟骨細(xì)胞組（其中BMSCs：軟骨細(xì)胞=4∶1，對照組）。接種后7 d、14 d觀察軟骨細(xì)胞的修復(fù)及優(yōu)化情況。

1.2.2 BMSCs分離、培養(yǎng)和鑒定[9] 1月齡實驗兔術(shù)區(qū)常規(guī)消毒、鋪巾后行骨穿，用骨髓穿刺針在股骨及脛骨近端進(jìn)針，連接10 mL注射器，抽取骨髓液4～5 mL，注入含肝素和DMEM/F12的離心管內(nèi)，采用全骨髓貼壁分離篩選法分離、培養(yǎng)BMSCs細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀況，48 h后首次給予全量換液，流式細(xì)胞檢測抗原表達(dá)，選擇表面抗原CD29、CD90、CD105和CD45進(jìn)行鑒定，PBS為陰性對照，IgG-PE做為同型對照。

1.2.3 軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定[10] 取上述同一只兔，無菌條件下取雙側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨，以PBS沖洗3次，用眼科剪剪成1 mm×1 mm×1 mm軟骨塊，加入0.25%的胰蛋白酶37℃消化。用200目不銹鋼無菌濾網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞，接種到培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)，臺盼藍(lán)染色細(xì)胞活性>95%。取P3軟骨細(xì)胞以1×105/mL濃度接種于涂多聚賴氨酸的蓋玻片上培養(yǎng)3 d，4℃丙酮固定30 min，行Ⅱ型膠原免疫組化染色。

1.2.4 羊膜的制備與負(fù)載[11] 取健康剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦的羊膜并進(jìn)行相關(guān)傳染性檢驗，結(jié)果均呈陰性。在超凈臺上清洗并分離羊膜，用含1000 U/mL慶大霉素+25 μg/mL兩性霉素B的生理鹽水浸泡20 min后，用胰蛋白酶于消化30 min，去除雜質(zhì)細(xì)胞。制備成合適大小的羊膜于培養(yǎng)皿中，按比例接種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.5 CCK-8法檢測細(xì)胞存活率 細(xì)胞按照對照組與實驗組培養(yǎng)后，取細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，接種到96孔板中（100 μL/孔），37℃、5%CO2條件下過夜培養(yǎng)，隔天換液后加入10 μL CCK8試劑，37℃、5%CO2條件下孵育2 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定OD值，計算細(xì)胞存活率。

1.2.6 TUNEL檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞按照對照組與實驗組培養(yǎng)后，取細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，按照細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明逐步加入生物標(biāo)記素，在熒光顯微鏡下查找熒光陽性細(xì)胞，根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分率來計算DLBCL細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率。

1.2.7 Western Blot法檢測磷酸化蛋白表達(dá)水平 細(xì)胞按照對照組與實驗組培養(yǎng)后，收集細(xì)胞于冰上裂解2 h，4℃離心后收集蛋白上清液。測定蛋白濃度后，將各組蛋白濃度總量調(diào)整為30 μg/μL，加入到10%變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，轉(zhuǎn)膜后，用牛血清白蛋白封閉1 h，加入一抗4℃過夜。隔天用TBST洗膜3次，并加入二抗孵育1 h。TBST洗膜2次，TBS洗膜1次。用ECL顯色液進(jìn)行顯色，并對各泳道條帶進(jìn)行灰度掃描，得出相應(yīng)的蛋白表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS22.0軟件處理，采用單因素方差分析和Bonferroni's Multiple Comparison Test，結(jié)果用（x±s）表示。以P

2 結(jié)果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定

應(yīng)用Beckman counter流式細(xì)胞儀分析大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志抗原。如封三圖1所示，培養(yǎng)的第3代細(xì)胞已表達(dá) BMSCs細(xì)胞表型陽性特征，其CD29、CD90、CD105，陽性率分別為96.72%、98.53%、98.99%；CD45呈陰性，陽性率為0.53%。流式結(jié)果表明，收獲的高純度的BMSCs可用于下一步實驗。

2.2 軟骨細(xì)胞鑒定

經(jīng)ColⅡ免疫細(xì)胞化學(xué)染色可見細(xì)胞胞漿內(nèi)的ColⅡ染成棕黃色。Ⅱ型膠原免疫組化染色顯示，收獲的高純度軟骨細(xì)胞可用于下一步實驗，見封三圖2。

2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞存活率

CCK8檢測細(xì)胞存活率結(jié)果可知，與對照組相比，隨著培養(yǎng)時間的延長，實驗組軟骨細(xì)胞存活率顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P

2.4 TUNEL檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果

凋亡檢測結(jié)果可知，與對照組相比，隨著培養(yǎng)時間的延長，實驗組軟骨細(xì)胞凋亡率顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P

2.5 磷酸化蛋白表達(dá)水平

用Western Blot法測得結(jié)果可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原、磷酸化蛋白p-PKC和p-ERK蛋白含量的蛋白水平明顯上升，磷酸化蛋白p-p38和p-JNK的蛋白水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P

3 討論

人羊膜衍生膜（human acellular amniotic membrane，HAAM）是一種從細(xì)胞滋養(yǎng)層衍化而來的半透明的薄膜，羊膜具有抗黏附能力，炎性反應(yīng)輕，纖維包裹少；同時HAAM抗原性極低，控制排斥反應(yīng)的發(fā)生，具有良好的生物相容性[12，13]。羊膜基底膜上含有多種膠原蛋白、纖維連接蛋白、層粘連蛋白、糖蛋白和蛋白多糖等成分，這些有效成分增強(qiáng)了其抗拉力，為細(xì)胞生長提供了足夠的三維空間結(jié)構(gòu)；為細(xì)胞的增殖、分化提供豐富的營養(yǎng)成分，并且有利于種植在羊膜上的細(xì)胞粘附和生長[13，14]。羊膜作為一種良好易得的生物材料，易于加工、處理和運(yùn)輸，為組織工程學(xué)的研究提供了便利的條件。研究表明在人羊膜胞外基質(zhì)上負(fù)載培養(yǎng)的角膜細(xì)胞、結(jié)膜細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等均能良好生長，并保持原本的細(xì)胞功能[14，15]。

本研究為了探討羊膜衍生膜負(fù)載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過PI3K/MAPK信號通路對損傷軟骨的保護(hù)作用，研究結(jié)果表明隨著培養(yǎng)時間延長，軟骨細(xì)胞的存活率逐漸上升，細(xì)胞凋亡率逐漸降低，能夠分泌出Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原，說明軟骨細(xì)胞在羊膜衍生膜負(fù)載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的條件下可以生長良好，處于良性增殖狀態(tài)。PI3K/MAPK作為兩條經(jīng)典的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可顯著調(diào)控細(xì)胞增殖分化和細(xì)胞凋亡等過程[16]。PI3K是一種參與細(xì)胞生長及骨架重塑的重要磷脂酰肌醇激酶，也是重要的抗凋亡調(diào)節(jié)因子，活化后可導(dǎo)致脂質(zhì)底物磷酸化并激活下游AKT，通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Caspase3、NF-κB、mTOR等，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡與代謝過程[17，18]。同時，在哺乳類細(xì)胞中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)三條并行的MAPK信號通路，分別是p38MAPK、JNK/SAPK和ERK信號通路，它們在細(xì)胞的生長和分化、細(xì)胞的炎性反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等應(yīng)激反應(yīng)中起重要作用[19-21]。由Western Blot結(jié)果可知，磷酸化蛋白p-PKC和p-ERK的蛋白水平明顯上升，磷酸化蛋白p-p38和p-JNK的蛋白水平顯著降低，說明羊膜衍生膜負(fù)載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的條件下可以促進(jìn)PI3K信號通路的抗凋亡作用，且抑制MAPK信號通路的促凋亡作用，從而調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡的發(fā)展過程。

綜上所述，在羊膜衍生膜負(fù)載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的作用可以通過有效調(diào)控PI3K/MAPK信號通路，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展過程。進(jìn)一步了解羊膜衍生膜負(fù)載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對軟骨細(xì)胞的修復(fù)和活化機(jī)制，對治療軟骨損傷和骨關(guān)節(jié)疾病等具有重要的臨床意義。

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篇10

【關(guān)鍵詞】 骨質(zhì)疏松癥；健康教育；干預(yù)

1 健康教育干預(yù)對象

目前國內(nèi)外大多數(shù)研究者都將老年女性與圍絕經(jīng)期的婦女作為重要研究及干預(yù)對象。然而，一項對于中老年男性的骨質(zhì)疏松癥認(rèn)知調(diào)查發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松癥所引起的脊柱骨折在中老年男性中的發(fā)病率、病死率均大于女性，其主要原因是男性在日常生活中鈣攝入少、活動次數(shù)少、吸煙、酗酒等高危行為；老年男性也會因為體內(nèi)性激素的減少而發(fā)生原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥。因此，中老年男性應(yīng)該也是骨質(zhì)疏松癥健康教育的干預(yù)對象之一。熊恩富等[2]提出兒童及青少年時期患髖關(guān)節(jié)疾病并造成髖功能障礙，由于患側(cè)肢體運(yùn)動負(fù)荷減少及應(yīng)力負(fù)荷異常，導(dǎo)致患側(cè)肢體肌肉萎縮、骨發(fā)育不良和骨質(zhì)疏松。國外有學(xué)者也認(rèn)為骨質(zhì)疏松健康教育也應(yīng)該包括在校大學(xué)生。通過以上調(diào)查結(jié)論可以發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松癥的健康教育對象不僅不能單一的確定為中老年女性和圍絕經(jīng)期女性，還應(yīng)該包括青少年和中老年男性。

2 健康教育干預(yù)的實施者

原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥是一種代謝性疾病，涉及內(nèi)分泌科、骨科、放射醫(yī)學(xué)、婦科等專業(yè)。除醫(yī)院本身的骨質(zhì)疏松癥相關(guān)職能科室充分發(fā)揮其就診及咨詢的功能外，社區(qū)、居委會也應(yīng)該發(fā)揮其重要的作用；社區(qū)醫(yī)院是開展預(yù)防干預(yù)工作的最基層的衛(wèi)生機(jī)構(gòu)，社區(qū)醫(yī)護(hù)人員也是最具體工作的執(zhí)行者。所以，在預(yù)防原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生方面，社區(qū)起著關(guān)鍵的作用。徐霞等[3]通過本次調(diào)查，初步發(fā)現(xiàn)上海市骨質(zhì)疏松認(rèn)知度不高，關(guān)注度不足密切，高危人群的防治工作力度不夠。所以，醫(yī)院的醫(yī)護(hù)工作者是開展社區(qū)居民防治骨質(zhì)疏松癥工作的主導(dǎo)力量。那么，只有良好的社區(qū)護(hù)理，才可以有效地預(yù)防老年骨質(zhì)疏松癥以及隨之帶來的骨折。所以，實施骨質(zhì)疏松性骨折的一級預(yù)防是骨質(zhì)疏松癥最重要的措施之一。因此，由以上調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)：骨質(zhì)疏松癥相關(guān)科室的醫(yī)務(wù)人員以及社區(qū)護(hù)理工作者應(yīng)該是原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥健康教育的最佳實施者。

3 干預(yù)措施

目前對原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥缺乏有效的干預(yù)措施，因此，如何干預(yù)原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥是預(yù)防防治工作的重點。黃秋美等[4]在調(diào)查研究結(jié)果表明：原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的干預(yù)方式中健康講座結(jié)合電話訪談、及家庭訪問的干預(yù)效果比較好。因此，社區(qū)醫(yī)護(hù)人員應(yīng)該選擇正確的干預(yù)方式，按照正確的操作程序、規(guī)章制度進(jìn)行，以取得最佳的療效來減少原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率，增強(qiáng)人們的健康。

4 干預(yù)內(nèi)容

首先，應(yīng)該先普及原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的基本知識，大量研究表明居民對骨質(zhì)疏松癥缺乏全面的認(rèn)識，這些基本的知識內(nèi)容主要包括有：原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的病因-主要是由增齡所導(dǎo)致的體內(nèi)性激素突然減少及其生理性的退行性病變；主要的一些臨床表現(xiàn)為-疼痛（以整個腰背部為主）、身高縮短及駝背、脆性骨折的發(fā)生以及脊椎向后側(cè)凸對胸腔、腹腔壓迫造成腹脹、反流性食道炎等癥狀。其次要認(rèn)識到原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的危害性及其危險因素。骨質(zhì)疏松癥的最大危害性為骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)生，骨折也會引起病人發(fā)病率、死亡率增加，功能的喪失及各種心理問題的出現(xiàn)。同時該病與生活方式是密切相關(guān)的，如吸煙、酗酒[5]、營養(yǎng)不良、低鈣飲食[6]、大量飲咖啡、累計的哺乳時間長、產(chǎn)孕次數(shù)多[7]、年齡增加[8]、長期使用激素、絕經(jīng)年齡早、家族遺傳、維生素D缺乏[9]等。最重要的是要了解原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防方法。通過流行病學(xué)調(diào)查指出，原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥是一種生活方式疾病，其發(fā)病很有可能通過改變不良的生活方式來降低，在日常生活中主要從以下幾個方面加以預(yù)防：①飲食預(yù)防：提供鈣和維生素D的膳食；②運(yùn)動預(yù)防：負(fù)重鍛煉如散步、慢跑、爬樓梯和跳舞等；③藥物預(yù)防：雌激素、降鈣素、甲狀旁腺素、二磷酸鹽以及一些中藥（如羊蕾、構(gòu)祀子、黃茂）[10]等；④日常生活中預(yù)防骨質(zhì)疏松性骨折；五、按時體檢和監(jiān)測預(yù)防骨質(zhì)疏松癥。

5 展 望

綜上所述，在我國開展原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥預(yù)防與控制的社區(qū)干預(yù)是一項十分復(fù)雜且艱難的過程，它不僅要求實施干預(yù)的醫(yī)務(wù)人員具備良好的專業(yè)知識，還要充分掌握與之相關(guān)的骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)知識。更重要的是需要根據(jù)受教育對象的具體情況選擇適當(dāng)?shù)慕逃绞?，對不同的人群實行個體化教育。逐步幫助干預(yù)對象掌握預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的知識，改變不良的行為生活方式，樹立良好的健康信念，培養(yǎng)健康的生活習(xí)慣，以預(yù)防該病的發(fā)生。這是目前控制和預(yù)防骨質(zhì)疏松癥及骨折的發(fā)生，提高患者生活質(zhì)量最經(jīng)濟(jì)、最有效、最簡便的措施。

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